[发明专利]鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统

说明书

本发明属于物种基因测序技术领域，公开了一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物；获取pUC57质粒骨架；构建同源重组质粒；质粒提取；用提取的质粒对野生型Z.mobilis 8b进行电转化；阳性克隆验证；构建目的sRNA过表达菌株；确定作用对之间是否有相互作用。本发明提供的方法方便快捷，相比于传统的EMSA方法，操作简单；本发明基于流式细胞术的单荧光报告基因系统，能快速确定sRNA与靶基因编码区域之间是否存在相互作用关系，便于批量操作；也可以应用于除运动发酵单胞菌以外的其他物种中使用。

技术领域

本发明属于物种基因测序技术领域，尤其涉及一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统。具体涉及一种基于Ptet诱导融合表达荧光报告基因opmCherry及sRNA与靶基因作用位置的检测系统及应用。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：随着高通量测序技术的快速发展，大量的物种基因组得以测序并给予注释，其中非编码序列中的小RNA(small RNAs,sRNAs)作为一个在细胞生长过程中起重要作用的调控因子，也被大量发现、挖掘和鉴定。sRNAs有不同的作用模式，大多数是与靶mRNA相互作用以控制mRNA的翻译过程，还可以与蛋白质相互作用形成作用复合物或控制蛋白质含量。其中，sRNA与其靶mRNA的相互作用可能发生在5’UTR(5’un-translational region)非编码区域，也可能发生在编码区域(coding region)，对其相互作用位置的准确定位及相互作用的强度鉴定非常重要，有利用实现对基因表达的准确调控。但是，现有技术EMSAs(electrophoretic mobility shift assays)来检测sRNA-RNA的相互作用需要在体外进行，需要对RNA进行体外转录或者带上标签后进行破细胞提取，并且RNA易降解，对环境及操作要求高，在体外进行相关凝胶实验、制备探针操作繁琐，也不便于批量操作，同时聚丙烯凝胶具有一定毒性。以上这些不足给相关研究的研究造成了困难，使得相关研究进展缓慢。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)需要在体外进行实验，实验材料不易获取。

(2)RNA不稳定，在体外容易降解，对环境和实验操作要求较高。

(3)EMSAs相关实验操作操作繁琐，不便于批量研究，同时不能准确定目的sRNA与其靶编码区域之间相互作用关系。

解决上述技术问题的难度：

(1)需要一种方便的实验材料获取方法。

(2)需要一种可批量的、简易快捷、的定量检测方法。

(3)需要提高实验的安全性。

解决上述技术问题的意义：

解决上述技术问题可以提供一种方便、快速、安全、可批量化的研究sRNA-RNA相互作用的定量方法，有利于加快相关领域的研究进展。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法及检测系统。

本发明是这样实现的，一种鉴定sRNA与靶mRNA编码区域的作用关系的方法包括：

步骤一，利用生物信息学方法对靶基因的启动子序列进行分析，确定启动子序列；

步骤二，针对目的基因的启动子特异性设计4条特异性引物，用于扩增得到上下游同源臂；

步骤三，以Zymomonas mobilis ZM4gDNA为模板，分别以引物1+引物2、引物3+引物4扩增得到上下游同源臂；

步骤四，用含有筛选诱导功能区的质粒作为模板，扩增得到筛选诱导功能区片段；