[发明专利]一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途在审

申请号：	201910116481.5	申请日：	2019-02-15
公开（公告）号：	CN109777782A	公开（公告）日：	2019-05-21
发明（设计）人：	芦志华;朱滨;董明洁	申请（专利权）人：	北京门罗生物科技有限公司
主分类号：	C12N5/10	分类号：	C12N5/10;C12N15/90;C12N15/864;A61K35/17;A61P35/00;A61P37/06;A61P37/02;A61P37/08
代理公司：	北京领科知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 11690	代理人：	张丹;徐丹丹
地址：	102206 北京市昌平***	国省代码：	北京;11
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摘要：
搜索关键词：	通用型内源性启动子制备基因同源重组表达水平均匀一致生理水平细胞因子正常生理基因抗肿瘤介导敲除受控输注细胞调控应用安全
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【权利要求书】：

1.一种通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞的TCR恒定区基因敲除，并在敲除的原位同源重组一段编码CAR基因的序列。

2.如权利要求1所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述同源重组是通过重组腺相关病毒载体实现的。

3.如权利要求2所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述同源重组发生在T细胞的TCR恒定区基因的外显子前。

4.如权利要求2或3所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体包含如下操作性连接的序列元件：5’末端反向重复序列(5’ITR)、3’末端反向重复序列(3’ITR)及编码CAR基因的序列。

5.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体进一步包含如下操作性连接的序列元件：SA序列、2A序列、PolyA序列、5’HA序列、3’HA和5’、3’末端反向重复序列。

6.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体中所述的CD19CAR(4-1BB)序列包含SEQ ID NO:4所示的序列。

7.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述腺相关病毒载体中所述的5’基因组同源序列(5’HA)包含SEQ ID NO:1所示的序列；所述的SA序列包含SEQID NO:2所示的序列；所述的2A序列包含SEQ ID NO:3所示的序列；；所述的PolyA序列包含SEQ ID NO:5所示的序列；所述的3’基因组同源序列(3’HA)包含SEQ ID NO:6所示的序列；所述的5’末端反向重复序列包含SEQ ID NO:7所示的序列；3’末端反向重复序列包含SEQID NO:8所示的序列。

8.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述重组腺相关病毒载体包含与SEQ ID NO:9所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。

9.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，在同源重组之前，所述T细胞事先经CRISPR/cas9系统敲除TCR基因。

10.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述敲除TCR基因是通过将T细胞、Cas9蛋白与sgRNA混合进行电转实现的。

11.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述sgRNA来源于TCR恒定区域外显子上下游各250bp。

12.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述sgRNA包含与SEQ ID NO:13所示的序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。

13.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，其中所述细胞来源于健康志愿者。

14.如前述任意一项权利要求所述通用型CAR-T细胞，其特征在于，其中所述CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、任选的铰链区、跨膜区和胞内信号区。

15.一种制备通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括如下步骤：

1)在T细胞中引入sgRNA分子和Cas9蛋白敲除TCR基因；

2)在所述T细胞中引入包含CAR分子的重组腺相关病毒载体；

其中，步骤2)在步骤1)之后2小时内进行，并且所述sgRNA分子包含TCR恒定区域外显子上下游各250bp的靶区域互补的靶向结构域。

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