[发明专利]一种通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种使CAR的表达受控于内源性启动子的生理性通用型CAR‑T细胞及其制备方法和用途。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除TCR恒定区基因，同时使用AAV介导的基因同源重组技术在TCR恒定区精准插入CAR基因。从而获得受内源性启动子调控的CAR表达，将CAR的表达水平控制在正常生理范围内的通用型CAR‑T。这种CAR‑T的特点可异体输注，CAR的表达处于生理水平且均匀一致，没有显著的细胞因子风暴，更安全。本发明还涉及所述CAR‑T细胞的在抗肿瘤方面的应用。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地涉及通用型CAR-T细胞及其制备方法和用途。

背景技术

CAR-T是利用能够与特定抗原结合的抗体片段来识别肿瘤细胞表面的抗原的经过改造的T细胞。近年来，CD19抗原特异性CAR-T细胞用于治疗B细胞白血病和淋巴瘤临床试验中，显示出极高的反应率及持续的疾病缓解效果。嵌合抗原受体(CAR)赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相对于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。近年来，CAR-T技术在急性白血病和非霍奇金淋巴瘤的治疗上有着显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。

CAR-T治疗的原理如下：通过基因工程修饰，使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别单一肿瘤抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内进行细胞免疫治疗。CAR作为一种基因表达的嵌合蛋白包含与T细胞信号传导结构域连接的、抗体的抗原结合结构域(如：单链抗体scFv)。CAR-T细胞过继性免疫的显著优势在于：细胞免疫治疗更具精确性。CAR-T细胞过继免疫治疗系统应用基因修饰病人自体的T细胞，利用抗原抗体结合原理规避了依赖MHC限制的抗原呈递，从而具有精确的靶向性。同时克服了肿瘤细胞可能通过下调MHC分子表达以降低抗原呈递的免疫逃逸。

目前CAR-T疗法的研发主要集中在CAR的构建，通过多方面的修饰以增强CAR-T细胞的靶向性，免疫杀伤性、效用持久性及安全性。尽管CAR的构建已取得了诸多显著进展，然而，基于传统的CAR-T细胞过继性免疫治疗系统始终存在以下明显缺陷：(1)只能自体输注。目前CAR-T治疗血液系统疾病虽然能够取得很好的疗效，但是只能自体输注，即从患者体内抽取T细胞，进行基因修饰后扩增，然后再回输给患者。因此这种治疗方式不能像药物一样广泛应用。有的患者由于无法获得足够数量的T细胞而无法进行CAR-T回输，丧失了治疗的可能性。(2)制备繁琐：每一套靶向某单一肿瘤相关抗原的CAR-T系统均需要单独构建，并通过实验检测其安全性、靶向性和有效性，应用于临床的评价周期较长，耗时费力，经济性较差。(3)在CAR-T细胞过继免疫治疗过程中，对CAR-T细胞在体内的靶向能力、生物代谢情况缺乏有效的评价和监控手段，因而常导致治疗过度或治疗无效。

现在绝大多数的CAR-T临床实验都是使用的自体型CAR-T，但是病人自身的T细胞通常都存在质量与数量的缺陷；且自体型CAR-T的生产成本更加昂贵，大约为通用型CAR-T的五倍；自体型CAR-T需要私人定制，而通用型CAR-T能够做到现货供应(off-the-sheff)，节约时间。然而异体型T细胞上的抗原受体TCR可能会识别接受者体内的异体抗原，从而引发移植物抗宿主病(GVHD)；此外，异体T细胞上的HLA表达也会迅速地引起宿主免疫细胞排斥反应。因此使用ZFNs，TALENs以及CRISPR/Cas9等基因编辑工具，敲除异体T细胞上的TCR，MHC以及相关信号通路基因，从而防止异体型CAR-T的宿主排斥反应，是实现通用型CAR-T的关键一步。