[发明专利]基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗及制备与应用

权利要求书

1.一种基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于包含可溶性HA蛋白，该可溶性HA蛋白由能够表达禽流感病毒HA蛋白的重组修饰的杆状病毒表达；

所述的禽流感病毒为H7N9亚型禽流感病毒和H5N1亚型禽流感病毒中的至少一种；

所述的H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述的可溶性HA蛋白由MultiBac杆状病毒表达系统表达。

2.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

编码上H7N9亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示；

编码H5N1亚型禽流感病毒的HA蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的重组修饰的杆状病毒的基因组中v-cath基因和chiA基因被破坏失去功能作用并且在基因组中插入了单启动子基因盒。

4.根据权利要3所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的单启动子基因盒自上游至下游包括如下组件：多角体蛋白启动子和编码禽流感病毒的HA蛋白的基因。

5.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

用于构建重组修饰的杆状病毒的出发载体为pACEBac1。

6.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的杆状病毒为苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒。

7.根据权利要1所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗，其特征在于：

所述的重组修饰的杆状病毒的制备方法，包含如下步骤：

将禽流感病毒的HA基因插入到转递质粒并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染昆虫细胞，在昆虫细胞内包装，得到重组修饰的杆状病毒。

8.权利要求1～7任一项所述的基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

(1)提取禽流感病毒的基因组，将其反转为cDNA；设计引物，以禽流感病毒cDNA为模板，扩增得到HA基因；将HA基因插入到转递质粒pACEBac1的PH启动子后面，得到重组转递质粒；将重组转移质粒转化DH10MultiBac大肠杆菌，通过转座重组，分别获得重组杆状病毒质粒；最后用脂质体法分别将重组杆状病毒质粒转染sf9昆虫细胞，得到重组杆状病毒；

(2)将P1代重组杆状病毒以MOI＝0.1感染细胞密度为1.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养72h后收取上清液即为P2代重组杆状病毒，将P2代重组杆状病毒以MOI＝1感染细胞密度为2.5×10⁶cell/ml的sf9细胞，27℃悬浮培养96h后收集细胞，经超声波处理，得到可溶性的HA蛋白；

(3)将可溶性HA蛋白与佐剂混合，得到基于MultiBac杆状病毒表达系统的禽流感疫苗。