[发明专利]一种不同结核分枝杆菌同时鉴定用试剂盒及其鉴定方法

权利要求书

1.一种不同结核分枝杆菌同时鉴定的方法，其特征在于：该方法包括以下步骤：

S1：首先分别对牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌进行扩增，上游引物和下游引物为牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用引物，牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌分别使用两种探针；牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌分别扩增10个循环，检测牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌分别自扩增10个循环后各自的荧光强度；

S2：根据S1所测荧光强度，确定基础量K；基础K值为荧光强度与溶液体积的商；

S3：将需要检测的溶液进行处理，加入1种上游引物，一种下游引物和两种探针，扩增30个循环；

S4：对S3中30个循环后的细菌进行荧光检测，检测的荧光强度减去基础K值得到绝对荧光值，绝对荧光值与对照表进行对比，绝对荧光值与纯牛分枝杆菌和纯人结核分枝杆菌进行对比，最终定性确认溶液中包含哪一种结核杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种不同结核分枝杆菌同时鉴定的方法，其特征在于：采用如下引物及Taqman探针进行实时荧光定量PCR检测：

5’-AGCGCAACACTCTTGGAG-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用上游引物；5’-CCCGTAGCGTTACTGAGAAA-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用下游引物；人结核分枝杆菌有三个Taqman探针序列，分别为5’-CGAGTCG-3’、5’-CCGTGG-3’和5’-CTTCTCTT-3’；

牛分枝杆菌有三个Taqman探针序列，分别为5’-TTGACCAG-3’、5’-CTAAGATAT-3’和5’-CCGGTACGCC-3’。

3.根据权利要求1所述的一种不同结核分枝杆菌同时鉴定的方法，其特征在于：三个人结核分枝杆菌Taqman探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；三个牛分枝杆菌Taqman探针5’端标记JOE荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

4.一种用于权利要求1所述方法的试剂盒，其特征在于：试剂盒包含如下引物及Taqman探针进行实时荧光定量PCR检测：5’-AGCGCAACACTCTTGGAG-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用上游引物；5’-CCCGTAGCGTTACTGAGAAA-3’为鉴别牛分枝杆菌和人结核分枝杆菌的共用下游引物；人结核分枝杆菌有三个Taqman探针序列，分别为5’-CGAGTCG-3’、5’-CCGTGG-3’和5’-CTTCTCTT-3’；牛分枝杆菌有三个Taqman探针序列，分别为5’-TTGACCAG-3’、5’-CTAAGATAT-3’和5’-CCGGTACGCC-3’；其中，三个人结核分枝杆菌Taqman探针5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；三个牛分枝杆菌Taqman探针5’端标记JOE荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。