[发明专利]一种不同结核分枝杆菌同时鉴定用试剂盒及其鉴定方法

说明书

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种不同结核分枝杆菌同时鉴定用试剂盒及其鉴定方法；本发明利用人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的基因组差异，设计1条上游引物和1条下游引物，根据扩增的靶片段分别设计两组Taqman探针，并对两组探针进行不同的荧光标记，两组探针中各包含三条探针，通过PCR技术扩增后的基因荧光强度与标准荧光值进行比对，可快速鉴定细菌类型，可定性判断溶液中所含细菌类型，在临床上有更大的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种不同结核分枝杆菌同时鉴定用试剂盒及其鉴定方法。

技术背景

结核病是一种人和多种动物共患的慢性传染病。据WHO报导，全世界有2000万结核病人，每年有800～1000万的新增病例，而我国目前结核病人在600万左右，每年新增病例100～130万。结核病已经成为21世纪严重危机人类健康的疾病之一。自然界中存在着多种人结核分枝杆菌：人结核(或人型)分枝杆菌、牛分枝杆菌(或牛型)等其它人结核分枝杆菌。牛型人结核分枝杆菌不仅可以使牛发病，还可以侵害人和多种动物，奶牛是传播结核病给人类的最危险的动物，而且奶牛的结核患病率较高，与病牛长期接触，或不慎饮用含有人结核分枝杆菌的牛奶都有可能感染结核病，特别是在我国的一部分地区还有喝生奶的习惯，导致感染结核病的几率大大增加。牛人结核分枝杆菌的疗法与结核病疗法的不同点在于牛人结核分枝杆菌天生对抗结核标准药物之一的吡嗪酰胺耐药。有文献指出，在我国的结核病病人中有5％～10％的结核病是由牛分枝杆菌引起，因此，对于人结核分枝杆菌与牛分枝杆菌的鉴别检测显得至关重要。

目前，临床上对人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌的区别鉴定需要对菌株进行纯培养，同时采用生化方法鉴别，但是人结核分枝杆菌及牛分枝杆菌难以培养，即使培养成功所需时间也在8周左右，并且这些鉴别方法并不可靠，因此迫切需要研发一种快速鉴别检测方法。PCR检测在众多方法中尤显特异性强、敏感性高的特点，近几年来也大量的应用在了牛人结核分枝杆菌的鉴定上，但由于需对扩增产物开管进行电泳会产生大量的气溶胶，导致该方法产生大量的假阳性，所以在临床上没有得到进一步的应用。而荧光实时定量PCR则能为我们提供一种既快速又能有效避免气溶胶的方法。

实时荧光定量PCR技术(Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称RealTimePCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术(HIGUCHIR,FOCKLERC,DOLLINGERG,etal.KineticPCRanalysis:real-timemonitoringofDNAamplificationreactions[J].Biotechnology,1993,11:1026；韩俊英,曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用[J].国外医学遗传学分册,2000,23(3):177.，在此全文引用作为参考，如同全文叙述一样)。

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。具有灵敏度和特异性高、能实现多重反应、自动化程度高、无污染、实时和准确等特点，该技术在医学临床检验及临床医学研究方面有着重要的意义。目前，采用荧光定量PCR检测技术可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎类病毒、人结核分枝杆菌、细小病毒B19、EB病毒和人巨细胞病毒等多种病原体进行测定。与传统的检测方法相比具有灵敏度高、取样少、快速简便等优点。

本发明利用人结核分枝杆菌和牛分枝杆菌之间的基因组差异，设计1条上游引物和1条下游引物，根据扩增的靶片段分别设计两组Taqman探针，并对两组探针进行不同的荧光标记，两组探针中各包含三条探针，通过PCR技术扩增后的基因荧光强度与标准荧光值进行比对，可快速鉴定细菌类型，可定性判断溶液中所含细菌类型，在临床上有更大的应用前景。

发明内容