[发明专利]一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201910117363.6 | 申请日： | 2019-02-15 |
| 公开（公告）号： | CN109868280A | 公开（公告）日： | 2019-06-11 |
| 发明（设计）人： | 褚茂平;郭晓令;李超;陈显武 | 申请（专利权）人： | 温州医科大学附属第二医院;温州医科大学附属育英儿童医院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/867;C12N9/02 |
| 代理公司： | 温州名创知识产权代理有限公司 33258 | 代理人： | 陈加利 |
| 地址： | 325000 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 基因过表达 慢病毒载体 慢病毒 人源 一氧化氮合酶 构建 宿主细胞 可诱导型一氧化氮合酶 慢病毒包装质粒 制备方法和应用 分子克隆技术 绿色荧光蛋白 基因利用 实验基础 稳定表达 相应基因 转染效率 作用机理 再使用 空载 酶切 质粒 转染 标签 合成 细胞 基因 应用 研究 | ||
1.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体的制备方法，其特征在于，所述人源一氧化氮合酶2基因为NOS2基因，所述制备方法包括以下步骤：
①以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板，通过上游引物NOS2-F和下游引物NOS2-R对该模板进行PCR扩增获得NOS2基因，此上下游引物两端分别预先设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列，
所述NOS2-F的上游引物序列为：
CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT，
NOS2-R的下游引物序列为：
GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG；
②确认步骤①中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的NOS2基因；
③用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的NOS2基因和空载的过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后，回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和pLVX-IRES-ZsGreen1；
④采用T4 DNA连接酶将NOS2基因连接到pLVX-IRES-ZsGreen1上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。
2.一种如权利要求1所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体。
3.一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法，其特征在于，所述人源一氧化氮合酶2基因为NOS2基因，所述制备方法为：使用慢病毒包装质粒psPAX2和慢病毒包装质粒pMD2.G对所述NOS2基因过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2进行包装并通过转染293T细胞，得到NOS2基因过表达慢病毒。
4.如权利要求3所述的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：
S1：用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞并培养，待倒置光学显微镜下观察细胞达到70％-90％汇合度时准备转染；
S2：用所述过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G转染步骤S1中得到的293T细胞，过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2、慢病毒包装质粒psPAX2及慢病毒包装质粒pMD2.G的比率为2:1:1；
S3：对转染后的293T细胞进行细胞培养12h后，弃细胞上清液后再用PBS轻轻洗涤3次，重新加入新鲜的完全培养基后继续培养48h后回收细胞上清液，经低速离心、过滤、超速离心、吸弃上清后留沉淀，用冰上预冷的PBS重悬沉淀后得到所述人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒。
5.一种如权利要求3至4中任一所述的制备方法所制备的人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒。
6.人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒在合成可诱导型一氧化氮合酶中的应用。
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