[发明专利]一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒、相应基因载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种人源一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、NOS2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。本发明通过分子克隆技术，将普通质粒上的人源NOS2基因利用PCR扩增技术加上XhoI和BamHI酶切位点，并经酶切后连接到空载的过表达慢病毒载体上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体。再使用慢病毒包装质粒对NOS2基因过表达慢病毒载体进行包装，通过转染293T细胞，得到相应的慢病毒。本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒对宿主细胞转染效率高，能特异性、持续、高效的促进人源NOS2基因在宿主细胞中稳定表达。同时，本发明构建的NOS2基因过表达慢病毒载体能特异性合成可诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，并带有绿色荧光蛋白标签，为进一步研究人源一氧化氮合酶2(NOS2)的功能和潜在作用机理提供了实验基础。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，尤其涉及一种人源一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒载体、一氧化氮合酶2基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。

背景技术

NO是一种新型生物信使分子，广泛存在于多种细胞中。其结构简单、可快速透过生物膜进行扩散；NO分子中有一未配对电子，可形成自由基,从而可与超氧自由基、氧分子或过渡金属反应；此外，NO作为第二信使普遍存在于脊椎动物中，对血管的流速、流量及血管阻力起调节作用。人体的免疫功能、血小板凝集反应、记忆和神经传递等内环境稳定都与其有关。因此，NO受到人们的普遍重视。

NO是活性氮簇(RNS)的一员，由一氧化氮合酶(NOS)产生，可诱导型NOS (iNOS)是NOS的一种亚型，由NOS2基因编码。研究表明，iNOS在慢性神经变性疾病、炎症、梗阻性病变、肿瘤、移植/植入等行为中发挥重要作用。iNOS 的表达与信号通路中的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路、核因子(NF-kB)通路、蛋白激酶(PK)C通路、环腺营酸(cAMP)依赖PKA通路、核激素受体过氧化物酶体增生激活受体(PPAR)通路、磷脂酰肌醇兰羟基激酶(P13K)-蛋白激酶 B(Akt通路)、JAK/信号转导及转录活化因子(STAT)通路、血红素加氧酶(HO)-1/ 一氧化碳(CO)通路均密切相关。构建NOS2基因过表达慢病毒载体从而具有重要意义。

为实现NOS2基因在目的细胞中过表达，目前普遍采用将整合有NOS2基因的普通过表达质粒通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是对大多数细胞脂质体转染效率较低。因此，如何提高NOS2基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。

发明内容

未解决上述技术问题，本发明提供了一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体、一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒及其构建方法和应用。

本发明提供一种一氧化氮合酶2(NOS2)基因过表达慢病毒载体及其制备方法。制备方法包括以下步骤：

①以普通质粒pDoubleEx-EGFP-NOS2为基因模板，通过上游引物NOS2-F 和下游引物NOS2-R对该模板进行PCR扩增，预先在上下游引物两端分别设计加入XhoI和BamHI酶切位点序列以获取一氧化氮合酶2(NOS2)基因，所述 NOS2-F的上游引物序列为 CACCTCGAGATGGCCTGTCCTTGGAAATTTCTGT，NOS2-R的下游引物序列为GCGAGATCTTCAGAGCGCTGACATCTCCAG。

②确认步骤①在中的PCR产物大小为3462bp后回收纯化的一氧化氮合酶2 (NOS2)基因。

③用XhoI限制性内切酶和BamHI限制性内切酶分别对所述纯化的一氧化氮合酶2(NOS2)基因和空载过表达慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1进行双酶切后，回收纯化带有酶切粘性末端的NOS2基因和pLVX-IRES-ZsGreen1。

④采用T4 DNA连接酶将一氧化氮合酶2(NOS2)基因连接到 pLVX-IRES-ZsGreen1上，得到NOS2基因过表达的慢病毒载体 pLVX-IRES-ZsGreen1-NOS2。