[发明专利]一种精子顶体酶的提取方法

权利要求书

1.一种精子顶体酶的提取方法，其特征在于，所述提取方法以液-固萃取技术为基础，向精子中加入萃取液，采用Ficoll密度梯度离心法进行分离，萃取得到精子顶体酶；

所述萃取液包括尿素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述尿素的浓度为4-8M；

优选地，所述萃取液还包括Ficoll 400、Triton X-100或HEPES-氢氧化钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将精液离心留取精子沉淀；

(2)将步骤(1)的精子沉淀中加入萃取液，萃取后离心留取上清。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的转速为1800-2200g；

优选地，步骤(1)所述离心的时间为10-30min；

优选地，步骤(2)所述萃取的时间为50-70min；

优选地，步骤(2)所述离心的转速为1800-2200g；

优选地，步骤(2)所述离心的时间为8-12min；

优选地，步骤(2)所述萃取液与精子沉淀的比例为每1毫升精液离心得到的精子沉淀加0.8-1.2毫升萃取液。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括向萃取的上清中加入顶体酶稳定剂的步骤；

优选地，所述顶体酶稳定剂包括海藻糖；

优选地，所述海藻糖的浓度为0.2-0.4mol/L。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述顶体酶稳定剂还包括HAM’S-F10培养基；

优选地，所述HAM’S-F10培养基的体积浓度为45-55％；

优选地，所述顶体酶稳定剂还包括HEPES-氢氧化钠缓冲液；

优选地，所述顶体酶稳定剂与所述上清的体积比为(0.8-1.2):1。

7.一种精子顶体酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-6中任一项所述方法中的萃取液；

优选地，所述试剂盒还包括权利要求5或6所述方法中的顶体酶稳定剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括含有BAPNA的底物液、含有苯甲脒的终止液或HEPES缓冲液中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述BAPNA的浓度为40-60mg/mL；

优选地，所述苯甲脒的浓度为80-90mg/mL。

9.一种精子顶体酶的检测方法，其特征在于，采用权利要求7或8所述的试剂盒。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)将精液1800-2200g离心10-30min留取精子沉淀；

(2)将步骤(1)的精子沉淀中加入萃取液，精子沉淀与萃取液的比例为每1毫升精液离心得到的精子沉淀加0.8-1.2毫升萃取液，萃取50-70min后1800-2200g离心8-12min留取上清；

(3)向步骤(2)萃取的上清中加入顶体酶稳定剂，上清与顶体酶稳定剂的体积比为(0.8-1.2):1，得到待检样本；

(4)向步骤(3)的待检样本中加入含BAPNA的底物液，底物液与待检样本的体积比为(0.8-1.2):1；20-30℃孵育50-70min后加入含苯甲脒的终止液终止反应，终止液与待检样本的体积比为1:(1.8-2.2)；上机405nm波长检测吸光度，计算顶体酶活性。