[发明专利]一种精子顶体酶的提取方法

说明书

本发明提供了一种精子顶体酶的提取方法，所述方法包括以尿素溶液作为萃取剂，采用液‑固萃取技术将精子顶体酶萃取至液体中，并添加了顶体酶稳定剂保持酶的活性；本发明通过优选萃取剂和顶体酶稳定剂，并优化浓度配比，使其不损失酶活的前提下简化操作步骤，使顶体酶保存期达到14天以上；本发明工艺简单，可实现工业化大规模生产，可为企业带来良好的经济效益，具备广阔的前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种精子顶体酶的提取方法。

背景技术

顶体酶是受精过程中重要的蛋白水解酶，存在于精子头部顶体内膜与赤道膜之间。当精子与卵母细胞结合后，精子头部发生顶体反应，顶体外膜破裂，释放顶体酶溶解卵母细胞周围的放射冠和透明带，使精子穿过透明带与卵细胞融合完成受精。精子顶体酶活性降低可影响精子穿透卵母细胞透明带，从而导致受精失败。通过精液常规难以鉴别的不育原因患者，其顶体酶活性也低；顶体酶活性是判断男性精子功能和生育力强弱的重要评价指标。

目前市面上流行的检测试剂盒有深圳市博锐德生物科技有限公司生产的精子顶体酶活性定量测定试剂盒(固相BAPNA法)(粤食药监械(准)字2014第2401138号)，其检验原理是：以高分子聚合物将待测精子固着于聚四氟乙烯膜(PTFE)表面，通过特制的反应装置控制反应液与PTFE表面精子的接触与分离，达到实现检测精子顶体酶和终止反应的目的。检测被固相捕获精子的精氨酸酰胺酶活性，精子顶体内的精氨酸酰胺酶活性可反映全部顶体酶的活性。Nα-苯甲酰-DL-精胺酸-ρ-硝酰基苯胺(BAPNA)在精氨酸酰胺酶的作用下，分解产生黄色的硝酰基苯胺，通过测定硝酰基苯胺的产量推算出精氨酸酰胺酶的活性。该试剂盒由反应装置、5×精子浓缩洗液、缓冲液、底物液、吸光度转换液、终止液、泡沫板、微孔板组成。CN102353672A公开了一种精子顶体酶活性的固相滤膜检测方法，包括将精子吸附于固相滤膜表面；以离心或倾倒的方法去除固相滤膜表面除精子之外的液体和杂质；启动顶体酶活性检测反应：吸附于固相滤膜表面的精子与底物溶液接触，启动顶体酶活性检测反应；4-40℃反应30-120分钟；将底物与固相表面精子分离或者加入质控终止液；反应产物比色；通过比色得到的吸光光度值计算顶体酶活性。

利用固相BAPNA法检测精子顶体酶活性，需要利用特殊反应装置处理精液标本，对参加反应的精子数量要求较高，不适宜大范围推广，且过程中手工操作复杂，经过繁琐的洗涤、分离等前处理过程，无法实现大样本的同时检测，对操作人员专业要求较高；对标本要求检测时间不得超过3小时，不利于检测机构临床实施。

因此，提供一种操作简单、高效的检测精液中精子顶体酶活性的方法，提高检测模式的灵活性和多样性，便于临床检测机构开展实施，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

发明内容

针对现有技术的不足和市场的需求，本发明提供了一种精子顶体酶的提取方法，通过优选萃取剂和顶体酶稳定剂，并优化浓度配比，使其不损失酶活的前提下简化操作步骤，使顶体酶保存期达到14天以上，具备广阔的应用前景和巨大的市场价值。

本发明的目的在于提供一种操作简单、高效的提取检测精液中精子顶体酶活性的方法，实现多样本的同时检测；同时使处理后的精子顶体酶活性能保持14天以上，提高检测模式的灵活性和多样性，便于临床检测机构开展实施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种精子顶体酶的提取方法，所述提取方法以液-固萃取技术为基础，向精子中加入萃取液，采用Ficoll密度梯度离心法进行分离，萃取得到精子顶体酶；

所述萃取液包括尿素。

优选地，所述尿素的浓度为4-8M，例如可以是4M、5M、6M、7M或8M。

优选地，所述萃取液还包括Ficoll 400、Triton X-100或HEPES-氢氧化钠缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。