[发明专利]经修饰的T细胞、其制备方法及用途

说明书

本发明涉及基因编辑和肿瘤免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR‑T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。

本申请是申请号为201880002752.8、申请日为2018年5月8日、发明名称为“经修饰的T细胞、其制备方法及用途”的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因编辑和肿瘤免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR-T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。

背景技术

T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，在肿瘤患者体内，局部的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)含量很少，其获取和体外扩增比较困难，且CTL的亲和力低，限制了其在肿瘤的临床治疗中的应用。

T细胞过继转移是近年来获得较高关注的特异性、低毒性的抗肿瘤方法，包括例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行遗传修饰是最常用的生成肿瘤特异性T细胞的方法。

TCR基因转移技术是从肿瘤反应性T细胞中克隆TCR的α和β链，通过基因工程技术，以逆转录病毒或慢病毒作为载体，对初始T细胞进行抗原特异性TCR修饰，从而赋予T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，并提高T细胞与肿瘤的亲和力。利用TCR基因转移技术对患者自体来源的T细胞进行TCR基因修饰，经体外扩增，获取大量具有特异高效识别能力的T细胞，再过继回输给肿瘤患者，使之在体内发挥抗肿瘤作用。

CAR由胞外结构域、铰链、跨膜结构域和胞内结构域组成，所述胞外结构域通常衍生自单链可变片段(scFv)，所述胞内结构域具有一个、两个或三个(分别对应于第一、二、三代CAR)衍生自CD3Z和/或共刺激分子信号传导结构域(Kakarla and Gottschalk,2014)。尽管CAR-T细胞疗法在治疗CD19阳性的恶性血液肿瘤的早期临床研究中获得成功(Davialaet al,2014；Lee et al,2015；Maude et al,2014)，然而用CAR-T细胞靶向实体瘤抗原的临床应答非常有限。

因此，仍然需要获得能够有效抑制或杀伤肿瘤尤其是实体瘤的T细胞。

发明内容

在一方面，本发明提供一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中抑制性蛋白表达的步骤。

在一些实施方案中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。

在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3、Tim3及其组合。

在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1和TIM3的组合，PD1和CTLA-4的组合，PD1和LAG3的组合，CTLA-4和TIM3的组合，CTLA-4和LAG3的组合，TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和CTLA-4的组合，PD1、CTLA-4和LAG3的组合，CTLA-4、TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和LAG3的组合，或PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3的组合。

在一些实施方案中，通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统实施所述减少或消除。

在一些实施方案中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞内选自SEQ ID NO:5、6、13、17、22-26中一或多种的核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。