[发明专利]一种鸡安卡拉病检测方法

权利要求书

1.一种鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述的鸡安卡拉病检测方法包括以下步骤：

步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取RNA并反转录成cDNA；

步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；

步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用Clustal X进行比对，并通过Primer Express 3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；

步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为10⁷作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；

步骤五：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。

2.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤二中，获得的样品DNA模板的260/280比值1.8～2.0，浓度200～500ng/μL，适合后续的扩增反应。

3.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤三中，合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。

4.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤四中，荧光PCR反应体系：Takara 2×Taq PCR Master mix 12.5μL，上下游引物各0.5μL，引物浓度10μmol/L，探针1.0μL，探针浓度10μmol/L，DNA模版2.0μL，补水至25μL。

5.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤四中，荧光PCR反应程序：95℃30s；95℃5s，60℃30s，40个循环，于60℃30s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。

6.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤五中，灵敏度检测，具体步骤为：

(1)将FAdV-4合成质粒为阳性标准品；

(2)用紫外分光光度计测定质粒浓度，根据阿伏伽德罗常数换算为目的基因的拷贝数，以10倍梯度稀释至10¹拷贝/μL，对梯度稀释的阳性对照进行荧光PCR反应检测；

(3)对阳性标准品以10¹为单位进行倍比稀释，将得到的浓度为10⁹至10¹的9个模板使用步骤后的反应体系和反应条件进行扩增，验证所建立方法的灵敏度。

7.如权利要求1所述的鸡安卡拉病检测方法，其特征在于，所述步骤五中，特异性检测，具体步骤为：

(1)以FAdV-1、FAdV-2、FAdV-10各一份的Fiber全基因合成质粒；

(2)鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗的cDNA；

(3)1份FAdV-4合成质粒为模板，使用步骤四的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增，验证所设计引物探针及所建立方法的特异性。