[发明专利]一种鸡安卡拉病检测方法

说明书

本发明属于禽类疾病检测技术领域，公开了一种鸡安卡拉病检测方法；准备质粒和毒株：提取样品DNA；设计与合成引物、探针；确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV‑4合成质粒稀释浓度为10⁷作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。本发明特异性强，在对其它血清型的质粒和鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗cDNA产物进行扩增后，未出现扩增曲线或条带；灵敏度高，荧光PCR可做到10¹拷贝的数量级；稳定性强；TaqMan方法配套扩增试剂便宜且方法成熟，接受程度高，可满足检测要求，适用于鸡中HPS病毒的检测。

技术领域

本发明属于禽类疾病检测技术领域，尤其涉及一种鸡安卡拉病检测方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

心包积水综合征(Hydropericardium syndrome,HPS)又称鸡安卡拉病，病原为鸡腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)，属于无囊膜的线性单分子双股DNA病毒。FAdV血清型众多，分别为血清型1～7，8a，8b，9～11共12种，不同血清型会导致不同程度的包涵体肝炎。其中血清4型强毒株对雏鸡的致病能力较强，是导致HPS发生的主要原因。腺病毒科(Adenoviridae)分五个属，禽腺病毒属(adenovirus)是其中之一，禽腺病毒属又分为禽腺病毒A～E、鹅腺病毒A、隼腺病毒A、及火鸡腺病毒B共8个种。FAdV-4和FAdV-10同属于禽腺病毒C。

FAdV呈世界性分布，1987年在安卡拉镇首次发生了鸡安卡拉病，1989年也报道了在墨西哥该病的发生，随后在印度、伊拉克、秘鲁、智利、厄瓜多尔、俄罗斯等地该病陆续的暴发。2015年6月以来，我国多数省份也发生了此类症状。该病的临床症状为发病鸡常表现为食欲不振、贫血、粗乱的羽毛、鸡冠颜色变浅、嗜睡发生率增高等，死亡率高达30％-90％，造成巨大的影响和经济损失。发病鸡主要表现为精神沉郁、羽毛逆立、排黄色稀粪，突然倒地后两腿划空，数分钟内死亡，剖检可见心包积有淡黄色透明的渗出液；肝脏肿胀、充血、质地变脆，色泽变暗，并出现坏死；肾苍白或暗黄色。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有的检测方法特异性较差，灵敏度较差，稳定性较差。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鸡安卡拉病检测方法。

本发明是这样实现的，一种鸡安卡拉病检测方法，具体包括以下步骤：

步骤一：准备质粒和毒株：根据FAdV-1、FAdV-2、FAdV-4、FAdV-10的Fiber基因全序列合成质粒；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗，提取其RNA并反转录成cDNA；

步骤二：提取样品DNA：取20份鸡肝脏、脾脏、肾脏并提取DNA；

步骤三：设计与合成引物、探针：根据FADV的12种血清型的核苷酸序列，使用Clustal X进行比对，并通过Primer Express 3.0在高度保守区域设计特异性的荧光PCR引物、探针一套，并合成；

步骤四：确定荧光反应体系和反应程序；取FAdV-4合成质粒稀释浓度为10⁷作为模板，使用各自的反应体系和反应条件进行荧光PCR反应检测扩增；

步骤五：对鸡安卡拉病检测方法进行灵敏度检测和特异性检测。

进一步，步骤二中，获得的样品DNA模板的260/280比值在1.8～2.0之间，浓度在200～500ng/μL之间，适合后续的扩增反应。

进一步，步骤三中，合成后的引物、探针用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，-20℃保存。