[发明专利]一种高结瘤固氮植物的培育方法

说明书

本发明公开了一种高结瘤固氮植物的培育方法，在植物体内分别过表达或者同时过表达序列表中的SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，获得与正常植物相比具有高结瘤固氮能力的转基因植物。利用本发明构建的过表达载体转化受体大豆植株获得转基因植物，能够显著提高大豆的根瘤数目，对减少氮肥施用和提高大豆产量具有重大的意义。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及到大豆钙调素蛋白家族GmCaM7编码基因促进大豆根瘤数目的应用方法。

背景技术

大豆是重要的粮油经济作物，其特有的共生固氮能力可将空气中的氮气转化为可被植物吸收利用的氨态氮，为自身生长发育提供了必需的氮素营养。充分利用大豆根瘤介导的共生固氮过程，不仅对维系大豆的正常生长和产量具有重要作用，并且还利于减少施肥过多带来的环境污染，因而，挖掘和提高大豆共生固氮效率已成为农业可持续发展的重要途径之一。

根瘤是共生固氮的场所，根瘤的数目决定着共生固氮的效率，较多的具有固氮功能的根瘤数目能够显著提高N₂的固定效率，然而过多的根瘤数目也会影响植株的正常发育，因而豆类植物演化出了调节根瘤数目的机制，它们能够感知自身对氮素营养的需求，在不影响自身生长发育情况下保证氮素营养的生产和利用。

目前对根瘤数目调控的分子机制的研究主要集中在受体激酶介导的结瘤自调控信号通路（Autoregulation signaling pathway，AON）上，AON信号通路包括两个长距离运输信号（根起源的信号和叶起源的信号）。在根瘤原基形成的同时（根瘤菌侵染根毛后的3-5天），在根部产生一些可移动的信号肽分子CLAVATA3/endosperm surrounding region（CLE），CLE含有12-13个氨基酸，通过木质部运输至叶薄壁组织，与质膜上的LRR-RLK（Lucine rich repeat-Receptor like kinase）受体类激酶受体结合，开启结瘤自调控信号，并诱导一类被称为SDI（Shoot Derived Inhibitors）的物质从地上部分运至根中，抑制根系结瘤（Okamoto et al., 2013）。在百脉根中，两个来自根中产生的CLE多肽CLE-RS1和CLE-RS2被质膜上的LRR-RLK受体类激酶HAR1 (Hypernodulation Aberrant Rootformation1)识别，进而组成多肽-受体复合体发挥抑制根瘤数目的作用（Nishimura etal., 2002）。此外，在百脉根中又鉴定一个在根部发挥作用的超结瘤突变体tml(Too MuchLove)，研究发现地上的HAR1和地下的TML共同调控根瘤数目（Magori et al., 2009）；在苜蓿和大豆中也都发现了CLE受体，苜蓿的MtSUNN、大豆中GmNARK和百脉根的HAR1都是拟南芥atCLV1（CLAVATA 1）的同源蛋白，但是在豆科植物中分化出调节根瘤数目的功能（Nishimura et al., 2002; Searle et al., 2003; Schnabel et al., 2005; Mirzaeiet al., 2017）。

植物中的Ca²⁺结合蛋白很多，通过EF-hand结构域与Ca²⁺结合，如拟南芥中有大约250 种蛋白质包含结合Ca2⁺的EF-h1nd结构域（Day et al 2002）；在大豆中也有至少262个基因编码含有EF-hand结构域的蛋白质(Zeng et al 2017)。钙调素（Calmodulin，CaM）是其中一种Ca²⁺结合蛋白，也称为Ca2⁺传感器，拟南芥中有7个基因编码CaMs类蛋白，这类蛋白通过4 个EF-hand构象结合4 个Ca2⁺，参与调控众多类似转录和酶活性的重要生理过程。在大豆基因组中包括6种钙调素(CaMs)，这些钙调素家组蛋白在大豆根瘤数目调控的研究并未报道。相关的参考文献如下。