[发明专利]一种重离子辐射拟南芥菜基因组靶点的高效标记方法

说明书

本发明公开一种重离子辐射拟南芥菜基因组靶点的高效标记方法，涉及重离子植物辐射诱变育种机理研究领域，基于现有的报告基因在标记重离子辐射植物基因组靶点方面的不足的问题提出的，本发明采用拟南芥菜同源重组报告系作为实验材料，以该报告基因受到DNA双链断裂损伤发生同源重组修复后恢复报告基因活性的方式来高效标记重离子辐射植物基因组的靶点，通过PCR高保真扩增该重组片段及其侧翼基因组序列，克隆测序检测扩增序列碱基突变情况，从而标记重离子辐射植物基因组靶点。本发明的有益效果在于：该方法实验操作简单，标记效率高，且受DNA双链断裂特异诱导。

技术领域

本发明涉及重离子植物辐射诱变育种机理研究领域，具体涉及一种重离子辐射拟南芥菜基因组靶点的高效标记方法。

背景技术

诱变育种是利用物理和化学诱变剂，诱发植物遗传变异，在较短时间内获得优良基因变异资源的一种育种方法。诱变育种不但可以明显提高基因突变频率，也能有效拓宽变异类型(产生新基因)，丰富作物“基因库”。辐射诱变育种起始于上世纪20年代，1927年Muller使用X射线诱发果蝇产生大量变异，次年Stadler证明X射线可以诱发玉米和大麦突变。在此后的90年内，60多个国家利用辐射诱变育种技术在214个植物物种中利用辐射诱变技术育成3200多个作物新品种。

重离子是指原子序数大于2的失去部分或全部电子的原子，与一些传统的低传能线密度的辐射(如X射线和γ射线)相比，重离子辐射具有独特的物理学性质，如高LET(线传能密度)、布拉格剂量分布、径迹结构等。这决定了重离子辐射径迹的离散性和损伤诱导的密集性，在生物层面上表现为突变率高、突变谱宽，新性状丰富和生理损伤轻的特点。然而，目前重离子诱变的分子机制，特别是DNA损伤诱导突变发生之间的关键过程还不清楚，

重离子辐射具有较高的LET，能够在1～4nm距离内发生2～5次的能量沉积，这容易造成DNA分子成簇损伤，团簇内DNA损伤包含多个单碱基替换、插入缺失、DNA单链断裂和DNA双链断裂位点。

目前检测重离子损伤突变的主要方法是基于全基因组测序法，该方法能够提供全基因组水平的碱基突变情况，然而这种全基因组测序识别的突变很难界定其是否来自重离子诱导的团簇损伤。原因有二：1)全基因组测序使用的是辐射稳定数代的突变体材料，由于植物是顶端发育模式(没有固定的生殖细胞系)，绝大大多数突变在传代过程中丢失，可供分析的突变位点有限；2)无法确定突变是来自DNA內源损伤还是外源损伤。而传统的植物报告基因也可以用来对重离子作用的靶点进行标记。例如，YusukeKazama等构建了拟南芥菜黄色荧光蛋白(YFP)转基因报告系，在碳离子辐射后代(M2)筛选无黄色荧光表达的植株，这些植株中的YFP基因位点被重离子击中，导致功能缺失。YoshihiroHase等构建了叶毛调控基因GL1(GLABROUS1)F1代突变杂合体，在碳离子辐射后F1植株叶子上挑选无叶毛斑点，在这些斑点内的细胞中GL1野生型基因位点被重离子击中，导致功能缺失，产生gl1纯合突变。然而，上述两个实验体系的不足在于：1)实验过程繁琐、复杂；2标记效率低；3)非DSB特异诱导。

发明内容

本发明的解决的技术问题在于现有的报告基因在标记重离子辐射植物基因组靶点方面的不足，提供了一种重离子辐射拟南芥菜基因组靶点的高效标记方法。

本发明是采用以下技术方案解决上述技术问题的：

本发明提供一种重离子辐射拟南芥菜基因组靶点的高效标记方法，包括以下步骤：以模式植物拟南芥菜GUS同源重组报告系R3L66为材料，对拟南芥菜进行重离子辐照，待拟南芥菜萌发后提取DNA，对同源重组后序列进行特异性扩增和测序，以报告基因GUS发生同源重组作为高效标记重离子在拟南芥基因组上的作用靶点。

优选的，所述拟南芥菜同源重组报告系R3L66为通过在报告基因GUS内部引入完全同源、反向重复内含子片段，构成同源重组的底物序列使报告基因失去活性，报告基因的重组底物序列受到遗传损伤后，通过同源重组修复恢复报告基因的活性。