[发明专利]从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法有效
申请号: | 201910125091.4 | 申请日: | 2019-02-20 |
公开(公告)号: | CN110016462B | 公开(公告)日: | 2020-04-24 |
发明(设计)人: | 娄阳;吴海 | 申请(专利权)人: | 优睿赛思(武汉)生物科技有限公司 |
主分类号: | C12N5/0781 | 分类号: | C12N5/0781 |
代理公司: | 武汉河山金堂专利事务所(普通合伙) 42212 | 代理人: | 胡清堂 |
地址: | 430000 湖北省武汉市东湖开发*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 脾脏 细胞 高效 分离 单个 抗原 特异性 淋巴细胞 方法 | ||
1.一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法,所述脾脏细胞为经过普通抗原免疫的脾脏细胞,其步骤如下:
1)利用以生物素标记的CD4单克隆抗体、CD8单克隆抗体和CD14单克隆抗体对脾脏细胞进行负筛选,再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除T淋巴细胞和单核细胞得到CD4、CD8和CD14阴性的脾脏细胞,提高B淋巴细胞的相对丰度;
2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原,对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选,以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞,保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞;
3)利用7-AAD进行分选,去除死细胞;
4)用流式细胞仪,进行单细胞的筛选,得到目标淋巴细胞;
其中,所述预标记筛选抗原为与小分子荧光染料偶联的普通抗原,所述预标记筛选抗原的制备方法包括以下步骤:采用滴加方式进行偶联反应,分多次将包含亲和素的小分子荧光染料滴加到经生物素标记普通抗原中进行偶联,每次滴加后孵育使其偶联充分;其中包含亲和素的小分子荧光染料的用量为经生物素标记普通抗原的5倍以上。
2.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法,其特征在于:所述预标记筛选抗原为与包含亲和素的小分子荧光染料偶联且经生物素标记的普通抗原。
3.根据权利要求2所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法,其特征在于:所述预标记筛选抗原的制备方法还包括以下步骤:在包含亲和素的小分子荧光染料和经生物素标记普通抗原偶联完成后,根据偶联产物的大小,选择合适的分子筛离心管,除去未偶联的底物。
4.根据权利要求1所述从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法,其特征在于:所述步骤2)中荧光标记的IgM多克隆抗体为FITC标记的IgM多克隆抗体。
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