[发明专利]从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法

说明书

本发明公开了一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，本发明利用采用多重淋巴细胞表面标记物抗体的负筛选，以及快捷的荧光标记抗原物质方法的建立和利用荧光标记抗原物质来进行高特异性的筛选，从而实现对单个抗原特异性B淋巴细胞的高通量快速筛选，并且使最终获得抗体特异性B淋巴细胞的阳性率从传统杂交瘤方法的不足5％，提高至30％。所以，该方案不但能够极大程度缩短单克隆抗体开发的时间，而且能够大大提高所获得单克隆抗体的数量和多样性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地指一种从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法。

背景技术

B淋巴细胞简称为B细胞，主要来源于骨髓中的多能干细胞。哺乳类动物B细胞的分化过程主要可分为前B细胞、不成熟B细胞、成熟B细胞、活化B细胞和浆细胞五个阶段。其中前B细胞和不成熟B细胞的分化是抗原非信赖的，其分化过程主要在骨髓中进行；成熟B细胞将通过淋巴系统的循环进入到外周血中，在受到抗原刺激之后，能够进一步分化成合成和分泌抗体的浆细胞。浆细胞能够生成对某一抗原特异性的免疫球蛋白IgG，并将其释放到体液中，即成为免疫抗体。来源于同一种类型的B淋巴细胞的单一抗体，被称为单克隆抗体，由于其具有理化性状高度均一、效价高、生物活性单一、特异性高而又易于大量制备等优点，目前被广泛应用于生物和医学研究中。

现在单克隆抗体的开发，在很大程度上还依赖于1975年美国分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦创建的杂交瘤技术，即通过利用经免疫后动物的脾脏细胞和永生化的骨髓瘤细胞来进行融合后，产生杂交瘤细胞，并通过多轮筛选来获得能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞株。而该方法具有制备周期长、所产生的杂交瘤细胞存在基因的不稳定性、筛选的特异性和阳性率都较差、以及普适性差(即通过研发所获得某一物种的骨髓瘤细胞只能融合该物种的淋巴细胞，而不能应用于其他物种)等局限性，目前只被广泛应用于鼠单克隆抗体的制备上面。而对于兔、羊驼等其他种属的单克隆抗体，目前据研究所知，和鼠单克隆抗体相比，有着更加优良的特性，而无法或较难用传统的杂交瘤细胞方法获得。

因此，如何从经免疫后的动物体内，有效得分离出能特异性结合某目标抗原的抗体的B淋巴细胞，从而能够有效的分离出表达抗体的基因，并通过体外重组的方法来大规模生产单克隆抗体，是免疫学以及单克隆抗体开发领域一个方兴未艾的领域。而由于兔单克隆抗体存在着特异性好、亲和力高、多样化程度好等诸多优点，并且利用传统的杂交瘤方法来开发兔单克隆抗体存在着专利壁垒，因此利用分离单个B淋巴细胞的方法来开发兔单克隆抗体显得尤为重要。而目前对于兔单个B淋巴细胞的筛选存在着以下难点：

1、对于增强免疫之后，能够表达抗体的B淋巴细胞在脾脏中富集的时间点把握不准。

2、B淋巴细胞只有在特定的阶段才能够在膜表面产生能和抗原特异性结合的IgG分子；如果过早，在B淋巴细胞表面表达的是IgM分子，如果过晚，B淋巴细胞将基本分化成为浆细胞。因此，对于如何筛选到膜表位表达IgG分子的B淋巴细胞是技术难点。

3、目前，针对于兔B淋巴细胞表面CD分子的抗体工具种类较少，进一步增加了分选出特定阶段B淋巴细胞的难度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术在分离兔B淋巴细胞上的不足，提供一种快速并能够高纯度的从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法。

为实现上述目的，本发明所提供的从脾脏细胞中高效分离单个抗原特异性B淋巴细胞的方法，该方法的步骤如下：

1)利用以生物标记的非B细胞淋巴细胞表面标志物抗体对脾脏细胞进行负筛选，再利用亲和素磁珠与磁性分离原理去除非B细胞，以提高脾脏细胞中B淋巴细胞相对丰度；

2)利用荧光标记的IgM多克隆抗体和预标记筛选用抗原，对步骤1得到的脾脏细胞进行进一步负筛选，以流式细胞技术去表面不表达IgG分子的B细胞，保留与预标记筛选抗原结合的目标淋巴细胞；