[发明专利]一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法

权利要求书

1.一种无需包被而从脂肪中获取内皮祖细胞的非治疗目的的方法，其特征在于，经胶原酶消化脂肪获取的单个细胞，接种培养8~12h进行一次贴壁培养，培养后去除贴壁的细胞，将未贴壁的细胞置于另一培养瓶中继续进行二次贴壁培养，培养时间45-55后去除未贴壁细胞，即为所得的内皮祖细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其还包括进一步富集培养，其特征在于，对上述分离到的内皮祖细胞，利用胰蛋白酶消化，用生理盐水冲洗去除后，再加入胰蛋白酶消化，待鹅卵石样细胞收缩变圆后离心收集细胞，获得富集的原代内皮祖细胞。

3.如权利要求2所述的方法， 其特征在于，二次贴壁培养时间为48h。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶为Ⅰ型胶原酶，其浓度为0.05~0.2%的Ⅰ型胶原酶。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的胶原酶为Ⅰ型胶原酶的浓度为0.1%的Ⅰ型胶原酶。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述培养时采用的培养基为IMDM培养基、α-MEM、DMEM或者DMEM/F12培养基，其中添加血小板裂解物、VEGF、EGF和bFGF。

7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述培养中血管内皮生长因子VEGF，上表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF添加量各为8~12ng/mL，血小板裂解液为3~7‰（v/v)。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述培养中血管内皮生长因子VEGF，上表皮生长因子EGF，碱性成纤维细胞生长因子bFGF添加量各为10 ng/mL，血小板裂解液为5‰（v/v)。

9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中是采用0.05-0.25%（w/v）胰蛋白酶进行消化。

10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，其中是采用0.1%（w/v）胰蛋白酶进行消化。

11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，在富集培养获得原代内皮祖细胞后，继续传代培养，每3天换液一次，当细胞融合度率至80%~90%时进行传代。