[发明专利]一种无需包被的脂肪内皮祖细胞的高效分离和培养方法

说明书

本发明公开一种从人或动物自体脂肪组织中获取内皮祖细胞方法，包含脂肪内皮祖细胞的高效分离和富集，分离过程中无须提前包被培养皿，经体外进行扩增培养，所获得的内皮祖细胞纯度高，细胞干性和增值能力强，具有典型的内皮祖细胞形态，细胞表型以及摄取低密度脂蛋白和血管形成能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及内皮祖细胞的分离和纯化，尤其涉及一种从脂肪样本中获取内皮祖细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是能够增殖、迁移、粘附并分化为血管内皮细胞潜能的一种原始细胞，在修复血管内皮和促进血管生成中具有重要的作用。研究显示，EPC在心脑血管疾病、糖尿病血管病变、高血压、肝硬化及以血管生成为靶向的肿瘤治疗药物研究等方面均发挥重要作用。

EPC来源于骨髓，存在于骨髓、脐血、外周血，最新研究表明在脐带、胎盘、脂肪以及脏器的外膜中也发现EPCs的存在。目前，EPC的主要来源为骨髓和脐血。然而骨髓采取不便，而且受到个人身体状况的限制，脐带血来源EPC需要HLA配型，同时同种异体输入可能存在免疫排斥等副作用。脂肪来源丰富，利用胶原酶I消化法获得脂肪源细胞混合物，再利用差速贴壁培养法和差速消化法富集获得EPC，操作简单，易于重复，而且所得细胞培养要求低，体外扩增能力强，增殖时间短，克服了自体来源EPC数量低下，体外扩增缓慢等困难。

相关脂肪来源EPC获得方法的相关报道有传统的磁珠分离法、间充质干细胞分化诱导法和利用特定细胞外基质的诱导贴壁法。磁珠分选的优点是可以从复杂的细胞混合物中分离出很高纯度的目的细胞，然而分选的细胞中磁珠很难去除，影响临床应用，而且磁珠价格昂贵难以实现产业化生产；分化诱导法是利用培养体系诱导经酶消化的脂肪混合种子细胞中的间充质干细胞向EPC细胞分化，然而由该方法获得的EPC分化程度不均，分化操作过程难以控制和重复；利用细胞外基质经过诱导贴壁分选的EPC，一方面贴壁基质费用昂贵，另一方面细胞纯度与贴壁时间长短关系密切，细胞纯度难以控制，而且在EPC的贴壁诱导培养过程中存在动物来源血清的污染。

例如申请号200510029628.5，公开日期为2007年3月21号，发明名称为《一种分离人脂肪组织中EPC的方法》的中国发明专利申请，在其分离过程中使用纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)诱导细胞贴壁，不但费用昂贵，纯度受限，而且后期细胞培养过程中加入了大量的胎牛血清(1％～3％)等异源物质，对后期细胞的临床应用存在很大的安全隐患。又如申请号20171010189.8，公开日期为2017年5月31号，发明名称为《一种骨髓来源的内皮祖细胞培养方法》中把最初分离的细胞首先接种到FN预包被的培养皿中诱导贴壁，利用添加高浓度(10％，V/V)胎牛血清的培养体系培养一段时间，再利用胰蛋白酶消化细胞后，接种到培养瓶中进行差速贴壁培养(24h)和差速消化培养获得EPC细胞。此方法不但操作程序繁琐而且存在FN和血清等异源成分。

发明内容：

本发明提供一种无需包被的从脂肪中获取内皮祖细胞的方法，其特征在于经胶原酶消化脂肪获取的单个细胞，接种培养4～12h进行一次贴壁培养，培养后去除贴壁的细胞，将未贴壁的细胞置于另一培养瓶中继续进行二次贴壁培养，培养时间36～60h后去除未贴壁细胞，即为所得的内皮祖细胞。

其中，一次贴壁培养时间为6-10h，最优选为8h。发明人发现按已知技术的贴壁24h，其效果并不理想，经研究发现24h贴壁的细胞中含有大量间充质样干细胞，原代细胞不纯而且后期培养过程中存在目的细胞被覆盖的风险，发明人对贴壁时间进行了一系列的摸索，发现所述的培养合适的时间为4～12h，优选8h效果更佳。

优选地，二次贴壁培养时间为45-55h，最优选为48h。

优选地，所述的胶原酶为I型胶原酶，其浓度为0.05～0.2％的Ⅰ型胶原酶，更优选为0.1％的Ⅰ型胶原酶。