[发明专利]一种酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒及利用此试剂盒PCR扩增酵母菌菌落的方法

说明书

本发明公开了一种酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒及利用此试剂盒PCR扩增酵母菌菌落的方法。所示试剂盒包括：10×细胞裂解液、10×PCR反应液、dNTP、热启动Taq酶。与目前现有技术相比，该试剂盒无需经过加热煮沸，酚/氯仿抽提提取基因组等步骤，减少有毒物质的对实验人员的毒害；本发明操作快速、简便，节省了大量的时间；本发明直接裂解单克隆菌落，降低交叉污染，无假阳性；通过使用高PH的细胞壁裂解液，可以在短时间内对酵母菌细胞壁进行有效的裂解，充分释放酵母基因组，释放后的上清液与配套的PCR反应液混合后其PH值在PCR扩增的适宜范围内，可实现PCR快速扩增。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒及利用此试剂盒PCR扩增酵母菌菌落的方法。

背景技术

酵母菌是一种真菌微生物，其在自然界中分布广泛，属于典型的兼性厌氧微生物，可以将糖发酵成酒精和二氧化塘，广泛应用于食品领域，其次作为一种重要的工程菌，其在分子领域应用广泛，例如分子克隆领域作为真核生物受体细胞。在酵母分子克隆中，在对酵母菌进行外源基因的转化后需要进行PCR 以验证外源基因是否成功转化。传统的细菌进行菌落PCR时，可以直接挑取细菌的单菌落或者菌液进行，但是酵母菌不同于细菌，其细胞壁破壁困难，处理不当基因组释放不充分就会造成PCR扩增失败。

在对酵母菌基因进行PCR扩增时，传统的方法是对酵母菌总基因组进行提取之后再进行PCR扩增，这种方法可以获取纯度相对较高的基因组进行PCR扩增且扩增效果理想，但是针对酵母菌的转化率，研究人员可能需要对较多的菌落进行筛选鉴定，提取基因组不仅会耗费大量的时间，增加实验成本，且在基因组提取的过程中，由于样本较多，操作稍微不慎就会造成样本间的交叉污染，给后续实验带来困扰。

目前，酵母菌落PCR技术应用较为广泛，其免去了提取基因组的繁琐步骤，主要是预先对酵母菌进行细胞壁的处理，包括反复冻融破壁法，酶消化处理法，高温蒸煮法，延伸PCR预变性时间等，这些方法处理后的酵母菌虽可以有效的进行PCR扩增，但是预处理的时间也相对较长，操作繁琐，稳定性与扩增也有待进一步的提升。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒及利用此试剂盒PCR扩增酵母菌菌落的方法。开发出一种可以快速进行酵母菌菌落PCR扩增，且操作简单，结果稳定性好的方法。

本发明采取的技术方案为：

一种酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒，所述试剂盒包括：10×细胞裂解液、 10×PCR反应液、dNTP、热启动Taq酶。

所述10×细胞裂解液成分为：1L 10×细胞裂解液中含有：10-50mM KOH， 0.5-2.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠，20-60％聚乙二醇200(v/v)

进一步地，所述10X细胞裂解液成分优选为：1L 10×细胞裂解液中含有： 20mM的KOH，1.5％(w/v)十二烷基硫酸钠60％聚乙二醇200(v/v)。

所述10×PCR反应液成分为：1L 10×PCR反应液中含有：：100mM Tris-HCl， 500mMKCl，15mM MgCl₂，0.01％(w/v)明胶，0.1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚；所述10X PCR反应液的pH为8.3。

本发明还提供了利用所述的酵母菌菌落快速PCR扩增试剂盒PCR扩增酵母菌菌落的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)取酵母菌单菌落培养液；

(2)裂解酵母菌细胞；

(3)酵母菌基因组DNA进行PCR扩增；

(4)PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，观测扩增结果。