[发明专利]黄颡鱼杆菌样病毒全基因组克隆方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，本发明公开了一种黄颡鱼杆菌样病毒全基因组克隆方法。方法的步骤为：设计14条特异性引物用于反转录和14对特异性引物用于PCR，引物序列如SEQ ID No.1～SEQ ID No.14；提取黄颡鱼杆菌样病毒RNA；以提取的病毒RNA为模板，用上述引物分别添加到反转录和PCR反应体系，反应条件分段克隆克隆黄颡鱼杆菌样病毒全基因组，扩增的产物其中13个片段大小为2000bp，一个片段大小为1000bp，共计14个片段含盖黄颡鱼杆菌样病毒基因组全部序列。本发明提供了黄颡鱼杆菌样病毒全基因组的克隆方法，该方法不仅可以用于黄颡鱼杆菌样病毒全基因组的快速克隆，也可以用于研究黄颡鱼杆菌样病毒的分子生物学致病机制和分子流行病学调查，使用方便，具有良好的效果。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种黄颡鱼杆菌样病毒全基因组克隆方法。

背景技术

黄颡鱼是一种属于鲿科的硬骨鱼类，由于其优良的肉品品质，黄颡鱼已成为中国、日本、韩国、东亚和南亚等国家和地区的重要淡水养殖品种之一。黄颡鱼杆菌样病毒(Yellow catfishbacilliform virus，YCBV)是由本发明人从黄颡鱼中分离获得的一种感染黄颡鱼的病毒，目前还没有该病毒的任何相关报道。由于电镜观察显示病毒粒子程杆菌样，故将其命名为黄颡鱼杆菌样病毒。经本发明人克隆的黄颡鱼杆菌样病毒基因序列分析表明，黄颡鱼杆菌样病毒在病毒分类中与属于Obaniviridae(目前还没有对应病毒科的中文译名)病毒科，Oncotshavirus(目前还没有对应病毒属的中文译名)病毒属的大鳞大麻哈鱼病毒(Chinook salmon nidovirus 1)较为接近。黄颡鱼杆菌样病毒是单链正股RNA病毒，基因组全长约26000bp，包含四个开放阅读框，分别编码聚合蛋白1ab，糖蛋白S，基质蛋白M和核蛋白N。目前黄颡鱼杆菌样病毒与大鳞大麻哈鱼病毒基因组克隆方法均未见任何报道。

综上，本发明目的在于提供一种黄颡鱼杆菌样病毒全基因组克隆方法，应用于该病毒的全基因组克隆。该方法的建立对于研究黄颡鱼杆菌样病毒的分子生物学致病机制和分子流行病学调查具有重要意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克隆黄颡鱼杆菌样病毒全基因组的方法，应用于该病毒的全基因组克隆。本发明可以通过采用以下技术方案来实现：

1.本发明提供了黄颡鱼杆菌样病毒全基因组扩增引物，用于分段克隆黄颡鱼杆菌样病毒全基因组。

各个节段的反转录引物分别采用P1-R、P2-R、P3-R、P4-R、P5-R、P6-R、P7-R、P8-R、P9-R、 P10-R、P11-R、P12-R、P13-R和P14-R进行。以各节段反转录产物为模板，用P1-F/P1-R、P2-F/P2-R、 P3-F/P3-R、P4-F/P4-R、P5-F/P5-R、P6-F/P6-R、P7-F/P7-R、P8F/P8-R、P9-F/P9-R、P10-F/P10-R、 P11-F/P11-R、P12-F/P12-R、P13-F/P13-R和P14-F/P14-R十四对引物分别进行PCR扩增各个片段。

2.本发明提供一种克隆黄颡鱼杆菌样病毒全基因组的方法，包括病毒RNA提取方法，反转录和PCR扩增反应体系和条件。扩增产物在1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增的目的条带其中13个片段大小为2000bp，一个片段大小为1000bp，共计14个片段含盖黄颡鱼杆菌样病毒基因组全部序列。将目的条带进行割胶纯化回收，连接到PMD19-T载体进行测序。

本发明的有益效果体现在：

本发明所述的黄颡鱼杆菌样病毒全基因组扩增引物及扩增方法，扩增基因出的基因组包括了黄颡鱼杆菌样病毒基因组的全部序列，扩增出的片段1至片段14的大小介于1500bp至4000bp之间，方便产物的后续纯化及测序，操作简单实用。

附图说明

图1为黄颡鱼杆菌样病毒全基因组各个片段经PCR扩增后的的电泳结果。