[发明专利]一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法

权利要求书

1.一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：构建CRISPR/Cas9基因编辑载体：将荧光蛋白报告基因与编码sgRNA序列的DNA片段插入到携带CRISPR/Cas9的编辑载体中，分别构建用于检测编辑效率或脱靶效应的编辑载体；

检测所述编辑效率的编辑载体所采用的sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2，或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4；其中，T1的碱基序列如SEQ ID NO：01所示，T2的碱基序列如SEQ ID NO：02所示，T3的碱基序列如SEQ IDNO：03所示，T4的碱基序列如SEQ ID NO：04所示；

检测所述脱靶效应的编辑载体所采用的sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO：05所示的FAD2的靶序列；

步骤二：将步骤一构建好的载体利用农杆菌介导法转化植株，再利用荧光光蛋白报告基因筛选植株转基因后代；

步骤三：通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出被编辑的植株进而确定编辑效率，或计算脱靶频率：当C18：2=39%时判定FDA3位点突变，当C18：1=30%时判定FDA2位点突变；发生位点突变的植株数在总植株数中的占比即为编辑效率；通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组分筛选出的非预期基因突变的频率，即为脱靶频率。

2.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因；所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动；所述Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子启动；

所述sgRNA包含两条以FDA2基因为基础设计的两条靶序列T1和T2，或者包含两条以FDA3基因为基础设计的两条靶序列T3和T4；其中，T1的碱基序列如SEQ ID NO：01所示，T2的碱基序列如SEQ ID NO：02所示，T3的碱基序列如SEQ ID NO：03所示，T4的碱基序列如SEQID NO：04所示。

3.如权利要求2所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑效率上的应用。

4.一种CRISPR/Cas9基因编辑载体，其特征在于：包括单个sgRNA或两个sgRNA组成的表达元件、Cas9蛋白基因和mCherry荧光蛋白基因；所述mCherry荧光蛋白基因由种子特异性表达的At2S3基因启动子驱动；所述Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子启动；

所述sgRNA包含碱基序列如SEQ ID NO：05所示的FAD2的靶序列。

5.如权利要求4所述的一种CRISPR/Cas9基因编辑载体在检测CRISPR/Cas9基因编辑系统脱靶频率上的应用。