[发明专利]一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法

说明书

本发明涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法，属于生物工程领域，主要包括三个部分：首先为了快速筛选转基因植株，选择标记基因mCherry插入表达载体中；其次为了快速鉴定CRISPR/Cas9基因的编辑效率和脱靶频率，将脂肪酸脱氢酶FAD2、FAD3作为靶基因插入载体中；最后利用靶基因突变后脂肪酸组分的变化，通过检测转基因阳性植株中C18不饱和脂肪酸的组成快速简便地筛选出被编辑的植株和未被编辑的植株，从而快速、准确、高效地确定特定的CRISPR/Cas9基因编辑系统的编辑效率和脱靶效应。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及CRISPR/Cas9基因编辑，具体地，涉及一种评估CRISPR/Cas9基因编辑效率或脱靶频率的方法。

背景技术

CRISPR的全称是“Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats”，即成簇的、规律间隔的短回文重复序列，是基因组中一个含有多个短重复序列的位点，这种位点在细菌和古细菌胞内起到了一种获得性免疫的作用。通过CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，其中I类和III类需要多种Cas蛋白共同发挥作用，而II类系统只需要一个Cas9蛋白就能够发挥CRISPR系统的免疫作用。CRISPR簇序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时CRISPR转录为crRNA(CRISPR-derived RNA)，crRNA通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的外源DNA序列靶位点剪切双链DNA。所以当前CRISPR/Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA，这种人工设计的sgRNA通过碱基互补配对结合到靶序列，引导Cas9蛋白结合到特定区域发挥作用，实现定点编辑。通过理论的不断发展和技术的不断地推进，使CRISPR/Cas9在基因编辑中得到广泛应用。高效的CRISPR/Cas9系统可以极大地节省人力、物力和财力，故一个好的编辑载体将会推进实验的进程。近期，Wang等(2015)报道了一种新型的CRISPR/Cas9编辑载体，该载体中的Cas9蛋白基因由卵细胞特异性表达的EC1.2基因的启动子驱动，以此可以有效地避免组成型过表达启动子常产生的嵌合型T1代突变体。另外，该载体中两个串联的sgRNAs取代了传统的单个sgRNA，从而可以同时对两个甚至多个基因进行编辑，避免了传统的杂交方法获得多突变体过程中的基因连锁和基因渗透现象。

CRISPR/Cas9是继锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。这三种技术都是在特定的DNA靶序列产生DSBs，通过非同源末端连接(NHEJ)和同源修复(HDR)来修复DSBs，在修复DSBs的过程中发生自发错误或人为引入突变或修饰，对目的基因进行精准的定点修饰。相较于ZFN和TALEN，CRISPR/Cas9系统有着可用位置多、应用潜力大、操纵方便等许多优点，在2013年CRISPR/Cas9作用机制与使用方法得以明确后，ZFN与TALEN的使用逐渐减少，而CRISPR/Cas9系统呈现爆炸性增长，慢慢取代了前两代基因编辑技术，成为了主流的第三代的基因编辑的技术。但是如何高效地评估CRISPR/Cas9基因编辑效率的问题还有待解决。如果我们能够找到一种靶基因，通过待评估的CRISPR/Cas9编辑载体编辑后出现易于检测的表型，计算这种表型出现的频率即可得到编辑效率。明确了该编辑载体的编辑效率之后就可以对准确计算筛选突变体所需植株的规模提供参考，以及为该载体的大规模推广提供依据。