[发明专利]一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用

说明书

本发明公开一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用。本发明将枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因和透明颤菌血红蛋白基因在毕赤酵母中共表达，重组菌株经高密度发酵策略高效制备壳聚糖酶。利用该方法制备壳聚糖酶的酶活力高达50000U/mL以上，蛋白含量为高达16.0mg/mL。重组酶比酶活力为4065.7U/mg，最适pH为6.0，最适温度为55℃。利用该酶水解高浓度(≥10％)壳聚糖制备壳寡糖，壳寡糖得率大于75％，主要产物为二糖、三糖和四糖。本发明的壳聚糖酶制备方法产酶水平远远高于现有文献和专利的报道，且所产酶具有优异的水解特性，在工业生产壳聚糖酶及制备壳寡糖中具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种产壳聚糖酶的重组菌的构建方法及其应用。

背景技术

壳聚糖是几丁质部分脱乙酰的产物，由D-氨基葡萄糖和N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键随机连接而成的直链天然多糖。壳聚糖酶(EC3.2.1.132)是专一水解壳聚糖的酶类，从壳聚糖链中随机切割β-1,4-糖苷键，产物为壳寡糖及氨基葡萄糖。基于其序列同源性，壳聚糖酶被划分为糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)5、7、8、46、75和80家族(Thadathil et al.Food Chemistry,2014,150:392–399)。

近年来已有许多微生物产壳聚糖酶的文献和专利报道，但是大多数产酶水平偏低，难以用于工业化生产，仅一些微生物产壳聚糖酶的水平较高。如专利CN102399727A公开了一种枯草芽孢杆菌利用魔芋粉为碳源产壳聚糖酶的方法，酶活力为11762U/mL。Chen等将烟曲霉壳聚糖酶基因在巴斯德毕赤酵母中异源表达，酶活力为25000U/mL(Chen etal.Biotechnology Letters,2012,34:689-694)，这是目前已报道壳聚糖酶的最高产酶水平。

巴斯德毕赤酵母作为一种成熟、高效的表达系统，已广泛用于生产各种异源蛋白，高细胞密度发酵是获得高产量重组蛋白的有效方法。然而，高细胞密度培养需要大量氧气，致使甲醇诱导期间容易形成溶氧限制，并且由于生物量和消泡剂的增加，氧气的溶解度和传质效率逐渐降低，影响细胞生物量及目的蛋白的表达量(Yang et al.,BiotechnologyAdvances,2017,36(1):182-195)。透明颤菌(Vitreoscillastercoraria)血红蛋白能够促进氧气输送从而改善细胞呼吸和能量代谢。已有研究将其与半乳糖苷酶、磷脂酶等共表达改善高密度发酵时的溶氧限制问题，使细胞生物量和目的蛋白表达量大幅度提高(Wu etal.,Journal of BioscienceBioengineering,2012,113:332-337；Wang et al.,Enzymeand Microbial Technology,2012,50:22-28)。虽然许多壳聚糖酶基因被克隆表达，但未见利用共表达透明颤菌血红蛋白以提高壳聚糖酶表达水平的相关文献及专利报道。