[发明专利]一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法

权利要求书

1.一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、引物与探针设计：

选择沙门氏菌fimY位点、大肠杆菌O157：H7 Mannosyltransferase位点、布氏杆菌Omp31位点为靶基设计引物和探针；

步骤二、免疫磁珠的制备：

取0.1mL磁珠液于盛有1.0mL PBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mL沙门氏菌属免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL 1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；重复以上操作制备大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌免疫磁珠液；

步骤三、免疫磁珠分离：

无菌操作取20g检样至装有200mL蛋白胨水的带滤网无菌均质袋内，轻缓振荡30min；过滤检样上清液转移于离心管，5000r/min离心20min，弃上清液体，沉淀重悬于1.0mL PBST缓冲液中；取全部检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；小心移出管中液体，加入1.0mL洗液混匀，3min后移出洗液，重复清洗5次，加入0.5mL重悬液使吸附目标菌的磁珠重悬其中；带有目标菌的磁珠重悬液可直接用于细菌基因组DNA提取；

步骤四、模板提取：

取步骤二所得全部带有目标菌的磁珠重悬液10000r/min离心1min，弃上清；按细菌基因组DNA提取试剂盒提供的操作手册提取DNA；得到的核酸用NanoDrop 1000分光光度计测定其浓度和纯度；

步骤五、三重荧光RPA：

三重荧光RPA的反应体系为50μL，包括Rehydration Buffer 29.5μL，ddH₂O 3.3μL，Primer F(10μM)、Primer R(10μM)各1.5μL，Twist Ampn exon Probe(10μM)0.5μL，基因组DNA各1μL，最后加入MgAc(280mM)2.5μL；向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo RPA反应管中依次加入上述反应体系各成分，充分混匀后2000r/min离心10sec，将反应试管放在RPA荧光定量PCR仪7500Fast中进行实时荧光扩增，37℃恒温反应40min；

步骤六、结果判定：

RPA反应设置三个荧光通道(FAM、HEX、cy5)，反应过程实时收集荧光，反应结束后能收集到荧光信号，并有明显扩增曲线，方可判定为阳性。

2.根据权利要求1所述的一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，其特征在于，步骤一中所设计的引物和探针序列如表1所示：

表1多重荧光RPA扩增用特异引物及探针序列