[发明专利]一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法

说明书

本发明提供了一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS‑荧光RPA检测方法，包括以下步骤：步骤一、引物与探针设计；步骤二、免疫磁珠的制备；步骤三、免疫磁珠分离；步骤四、模板提取；步骤五、三重荧光RPA；步骤六、结果判定。本发明通过设计特异性的引物与探针，建立3种人畜共患病病原菌多重IMS‑荧光RPA检测体系，采用三重荧光方法，特异性很好，3种荧光信号的收集不会相互干扰，可同时检测三种人畜共患病病原菌；本方法简便快速，特异性好，敏感度高，抗干扰性强，适用范围广，检测成本低，适合基层推广应用。

技术领域

本发明涉及一种同时检测多种病原菌的方法，具体涉及一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法。

背景技术

畜牧业的迅猛发展，电商、各类网淘平台的崛起，给人民带来实惠的同时，互通有无的物流业增加了多种病原菌混合感染的风险。沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、布氏杆菌属于人畜共患病的病原菌，其中布氏杆菌属二类动物病原微生物，沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7属三类动物病原微生物。沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌均为具有高致病性的人畜共患致病菌，且普遍存在于环境中，如在食品、水、空气、纺织品和土壤中这三种菌均能长期生存、繁殖，并可在人群中广泛传播，造成严重疫情。目前我国对这三种病原菌的检测仍采用经典的传统分离培养、生化鉴定、血清学方法，为解决传统方法的检测周期长，步骤繁琐、大批量检测工作量大及成本高等问题，快速分子方法如荧光定量PCR、LAMP、 RPA技术不断得到发展与完善，近年，多重分子技术的研究已成为行业专家关注的热点。

免疫磁珠分离(Immunomagnetic separation，IMS)技术是一种具有高效、特异的样品预处理方法，其原理是利用磁珠表面的活性基团与目标菌抗体进行偶联，制成特异性免疫磁珠，然后在液相中与目标菌发生抗原抗体结合，经外磁场作用，将带目标菌的磁珠从复杂的样品基质中特异分离。该技术利用抗原抗体之间的特异结合，高效富集目标菌，并保留目标菌原有生物活性，利于下游的检测鉴别，是一种理想的样品预处理方法，被广泛应用于致病菌检测的样品预处理。

重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase ploymerase amplification，RPA)技术被称为是可以替代PCR的核酸检测技术(由英国公司TwistDx Inc开发)，首先，体系中重组酶和引物37℃条件下形成酶和引物的聚合体并在模板DNA上寻找完全互补的序列；定位后启动DNA合成；在扩增体系中加入一个荧光标记的探针，通过收集荧光即可实现检测过程实时监测。

目前，国内外还没有采用IMS技术结合RPA技术同时针对沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7、布氏杆菌3种人畜共患病鉴定的有关研究报道。本发明结合IMS、RPA两种技术优势，同时用3种特异性免疫磁珠分离基质中沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌，磁珠分离液可直接提取DNA，同时用3种特异性引物及探针，实现对沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和布氏杆菌的同时检测，达到微生物致病菌的快速、高效、高通量检测的目的。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS- 荧光RPA检测方法，达到快速、高效、高通量检测的效果。具体技术方案如下：

一种同时检测3种人畜共患病病原菌的多重IMS-荧光RPA检测方法，包括以下步骤：

步骤一、引物与探针设计：

选择沙门氏菌fimY位点、大肠杆菌O157：H7Mannosyltransferase位点、布氏杆菌Omp31 位点为靶基设计引物和探针，表1所示；

表1多重荧光RPA扩增用特异引物及探针序列

步骤二、免疫磁珠的制备：