[发明专利]应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法

权利要求书

1.一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)脂肪脱细胞基质制备：

a.取人脂肪组织置于-80℃条件下冰冻20～40分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3～5个循环后，将解冻后的脂肪组织用机械乳化法制备成纳米脂肪；

b.将步骤a中的纳米脂肪离心后去除最上层油和最下层水，取中间一层并加入PBS缓冲液洗涤后离心后去除缓冲液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后离心去除消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡48～60h后离心去除异丙醇，最后用PBS缓冲液重复洗涤3～5次，每次加入PBS缓冲液混匀洗涤后离心去除缓冲液；

c.将步骤b中浸泡洗涤后的纳米脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后离心去除混合酶溶液，并加入PBS缓冲液重复洗涤3～5次，每次加入PBS缓冲液混匀洗涤并离心去除缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na₂HPO4、17mmol/LKH₂PO4、4.9mmol/L MgSO₄·7H₂O、15000U DNase、12.5mg RNase；

d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的纳米脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡6～10h后离心去除异丙醇，最后采用PBS缓冲液混匀洗涤后离心去除缓冲液得到脂肪脱细胞基质；

(2)可溶性脱细胞基质制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，离心去除α-淀粉酶水溶液，再采用浓度为0.2mol/L的醋酸浸泡40～50h后，在温度为4℃、转速为11000转/分钟的条件下离心5分钟后取上清液即为可溶性脱细胞基质；其中，每100mg脱细胞基质加入1ml浓度为0.2mol/L的醋酸；

(3)制作毛细管微流控芯片：将内径100～400um和500～1000um的玻璃毛细管嵌套0.5～5cm，并将嵌套后的两根玻璃毛细管固定在载玻片上，其固定后内层毛细管两端及外层毛细管与内层毛细管嵌套一端均置于载玻片上，外层毛细管未嵌套一端伸出载玻片，并在内层毛细管未嵌套端以及外层毛细管与内层毛细管嵌套端分别倒扣加样枪枪头，加样枪头底部边缘与载玻片密封连接，且连接后其两个加样枪枪头倒扣区域分别形成一个与内层毛细管连通的第一密封腔和一个与外层毛细管连通的第二密封腔，制成微流控芯片；

(4)将步骤(2)中的制备的可溶性脱细胞基质与浓度1％w/v～5％w/v的海藻酸钠水溶液等体积混合置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与内层毛细管相连的枪头开口端；将span-80与纯正癸醇混合后的溶液，其中span-80的质量体积比为5％，置于注射器中，用软管连接到微流控芯片上与外层毛细管相连的枪头开口端；并调节流速使得脱细胞基质-海藻酸钠混合溶液与正癸醇溶液流速比为1:1～1:20，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质-海藻酸钠液滴；

(5)将步骤(4)中获得的包裹有正癸醇的脱细胞基质-海藻酸钠液滴通入CaCl₂与纯正癸醇混合后得到的溶液，其中CaCl₂的质量体积比为1.5％， 静置16～24h后，然后在500～800转/分钟的条件下离心，去除液体获得海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体。

2.根据权利要求1所述的一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中胰蛋白酶-EDTA消化液浸泡、异丙醇浸泡、混合酶溶液浸泡以及PBS缓冲液洗涤时，每种浸泡液和洗涤液分别与脂肪的体积质量比为1:1。

3.根据权利要求1所述的一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中处理后得到脂肪脱细胞基质浸泡保存在温度为4℃、浓度为75％的酒精中。

4.根据权利要求1所述的一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，其特征在于：所述步骤(1)中b步骤的纳米脂肪是在室温、2000转/分钟下离心4～6min后吸去最上层油和最下层水吸去，取中间层加入PBS缓冲液混匀洗涤30min后在1500～2500转/分钟的转速下离心，吸去缓冲液。