[发明专利]应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法

说明书

本发明提供一种应用微流控芯片制备海藻酸钙‑脂肪脱细胞基质微载体的方法。其方法具体如下：取人脂肪组织反复冻融后乳化得到纳米脂肪，并离心去除上层油和下层水，取中间层采用PBS缓冲液、胰蛋白酶‑EDTA消化液、异丙醇、混合酶溶液进行脱细胞处理，再用α‑淀粉酶水溶液和醋酸浸泡萃取离心取上清液，并与海藻酸钠溶液等体积混合作为分散相通入微流控芯片，将含有span‑80的正癸醇作为连续相通入微流控芯片，获得包裹有正癸醇的脱细胞基质‑海藻酸钠液滴，最后通入含有CaCl2的正癸醇溶液进行交联过夜，洗涤去正癸醇后即获得海藻酸钙‑脂肪脱细胞基质微载体。本发明能够生产成分均一的脱细胞基质微载体，得到的微载体更利于细胞生长，可用于脂肪干细胞培养。

技术领域

本发明属于组织工程生物支架微载体，具体涉及一种应用微流控芯片的海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的构建方法，可增加脂肪干细胞的黏附，是一种新型微载体。

背景技术

软组织缺损是临床面临的常见难题。现有的皮瓣移植、脂肪填充、透明质酸填充等方法存在有创伤、填充物易吸收、炎症反应等缺点。组织工程的方法将种子细胞和生物支架材料结合后进行填充，可以很大程度避免这些问题，但目前常用的生物支架材料如壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸，不具备促进干细胞黏附、增殖、分化的能力。

脂肪脱细胞基质是脂肪组织去掉细胞后剩余部分，主要成分包括胶原蛋白和VEGF、GAG等多种生长因子，可促进脂肪干细胞黏附、增殖、成脂分化。但是脂肪脱细胞基质为絮状结构，难以制备为载体。微流控芯片可以在微观尺度上操作液体，利用液体剪切力可制备大小成分均一的液滴；海藻酸钙是微流控技术制备微载体时常用的可降解材料，但其细胞亲和性欠佳，难以用于干细胞培养。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，该方法能够生产大小、成分均一的脱细胞基质微载体，可用于于脂肪干细胞培养。

本发明提供的技术方案：所述一种应用微流控芯片制备海藻酸钙-脂肪脱细胞基质微载体的方法，其特征在于具体步骤如下：

(1)脂肪脱细胞基质制备：

a.取人脂肪组织置于-80℃条件下冰冻20～40分钟，然后取出，在室温下静置至完全解冻，如此反复冻融3～5个循环后，将解冻后的脂肪组织用机械乳化法制备成纳米脂肪；

b.将步骤a中的纳米脂肪离心后去除最上层油和最下层水，取中间一层并加入PBS缓冲液洗涤后离心后去除缓冲液，用胰蛋白酶-EDTA消化液在37℃下浸泡16～24h后离心去除消化液，再加入异丙醇在37℃下浸泡48～60h后离心去除异丙醇，最后用PBS缓冲液重复洗涤3～5次，每次加入PBS缓冲液混匀洗涤后离心去除缓冲液；

c.将步骤b中浸泡洗涤后的纳米脂肪加入混合酶溶液在37℃下浸泡16～24h后离心去除混合酶溶液，并加入PBS缓冲液重复洗涤3～5次，每次加入PBS缓冲液混匀洗涤并离心去除缓冲液；其中所述混合酶溶是由以下比例的物质配制而成：55mmol/L Na₂HPO4、17mmol/L KH₂PO4、4.9mmol/L MgSO₄·7H₂O、15000U DNase、12.5mg RNase；

d.将步骤c中混合酶浸泡洗涤后的纳米脂肪再次加入异丙醇在37℃下浸泡6～10h后离心去除异丙醇，最后采用PBS缓冲液混匀洗涤后离心去除缓冲液得到脂肪脱细胞基质；

(2)可溶性脱细胞基质制备：将步骤(1)中制备的脂肪脱细胞基质采用重量体积比为0.3％的α-淀粉酶水溶液浸泡70～75h后，离心去除α-淀粉酶水溶液，再采用浓度为0.2mol/L的醋酸浸泡40～50h后，在温度为4℃、转速为11000转/分钟的条件下离心5分钟后取上清液即为可溶性脱细胞基质；其中，每100mg脱细胞基质加入1ml浓度为0.2mol/L的醋酸；