[发明专利]从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及其应用

权利要求书

1.一种无血清的制备造血祖细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)提供多能干细胞；

(b)对所述多能干细胞进行悬浮培养，从而形成拟胚体(embryoid body，EB)；

(c)在化合物GSK-3β抑制剂、BMP-4、bFGF和VEGF存在下，对所述拟胚体进行诱导培养，从而形成中胚层；

(d)在化合物TGF-β抑制剂、BMP-4、bFGF和VEGF存在下，对所述中胚层进行诱导培养，从而形成生血内皮细胞；和

(e)在包括SCF和TPO的血液细胞生长因子组合存在下，对所述生血内皮细胞进行转化培养，从而获得造血祖细胞；

其中所述的GSK-3β抑制剂为下列化合物之一或其组合：NP031112、TWS119、SB216763、CHIR-98014、AZD2858、AZD1080、SB415286、LY2090314和CHIR99021；

所述的TGF-β抑制剂为下列化合物之一或其组合：A-83-01、GW6604、IN-1130、Ki26894、LY2157299、LY364947(HTS-466284)、LY550410、LY573636、LY580276、NPC-30345、SB-431542、SB-505124、SD-093、Sm16、SM305、SX-007、

Antp-Sm2A、LY2109761。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，包括：对所述多能干细胞进行消化处理，从而形成单细胞悬液。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，采用accutase消化酶进行处理。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，多能干细胞的接种浓度为0.1×10⁶-5×10⁶/mL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，在添加了ROCK抑制剂的CD34A中进行培养，所述CD34A的培养基组成如下：基础培养基、终浓度为2~200μg/mL的转铁蛋白、终浓度为100~400μM MTG，终浓度为20~100μg/mL的维生素C，终浓度为0.5~5mM的谷氨酰胺，终浓度为0.5~5μg/mL的重组人胰岛素。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ROCK抑制剂选自下组：Blebbistatin、HA-100、Y-27632、HA-1077、KD-025、Y-33075、Narciclasine或其组合。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述的ROCK抑制剂是Blebbistatin。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，悬浮培养的时间为4-32小时。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，GSK-3β抑制剂的浓度是0.1-20uM。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，培养时间为1-3.5天。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，所述BMP-4浓度为1-50ng/mL；bFGF浓度为0.5-50ng/mL；以及VEGF浓度为1-100ng/mL。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，TGF-β抑制剂的浓度是0.1-10uM。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(d)中，培养时间为0.5-4天。