[发明专利]从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及其应用

说明书

本发明提供了从人多能干细胞分化为造血祖细胞的方法及应用。本发明还提供了从多能干细胞分化形成的并且具有CD34+KDR+CD43‑CD73‑表型的造血祖细胞。本发明方法可以在无血清条件下高效、快速地制得分化效果稳定的造血祖细胞，并且所述的造血祖细胞是同时具有红系、髓系及淋巴系的分化能力的造血祖细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及从人多能干细胞分化为造血祖细 胞的方法及其应用。

背景技术

血液病是原发于造血系统的疾病，或影响造血系统伴发血液异常改变，其常 表现为贫血、出血、发热等症状。

我国儿童恶性癌症的发病率呈上升趋势，截止2014年的数据显示，儿童恶 性肿瘤中，白血病的发病率居第一位，约占三分之一。对于恶性血液系统疾病而 言，临床上的化疗效果往往不甚理想。自从二十世纪中期Thomas教授首先开展了 造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)移植以来，HSC移植广泛地被应用 于白血病的临床治疗中，已经成为治疗急性白血病、恶性淋巴瘤、重型再障等病 的有效手段之一。

目前HSC主要来源于脐带血、骨髓和外周血。HSC移植主要分为自体和异体 HSC移植两种。尽管自体移植具有无移植排斥、无移植物抗宿主病等并发症的优 点，但脐血库储存的自体HSC数量供不应求，使其在疾病中的临床应用中受到限 制。异体移植虽然远期疗效优于自体移植且复发率低，但是配型效率极低，来源 有限，从而限制了异基因HSC移植的临床应用。

因此，目前本领域迫切需要寻求更为安全、成本较低、来源稳定的HSC资源。 人多能干细胞具有分化为几乎所有类型体细胞，包括造血干细胞的能力。人多能 干细胞包括人胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和人诱导多能干细胞 (induced pluripotentstem cells，iPSC)。

研究表明，小鼠、猴子和人的ESC在体外都可以被诱导分化为各种血液细胞， 但是ESC来源于发育早期的胚胎，存在取材困难、免疫排斥、伦理道德等问题。

人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPSC)可由人体皮肤、 血液等体细胞在体外重编程而来，且具有和ESC类似的无限增殖能力，及在体外 分化为几乎所有功能细胞，包括造血干细胞的能力。iPSC这一特性成功地绕开了 免疫排斥和伦理性两个最关键的问题，为临床上获得体外来源的造血干细胞进行 临床移植应用提供了可能性。

目前已有多篇研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为各种类型的造血祖 细胞的方法。

Chadwick K等报道了在外源加入BMP-4和细胞因子混合物的作用下，使用拟 胚体分化的方法可以从人多能干细胞得到CD45阳性的造血祖细胞(Chadwick K et al.,2003)。

Ledran MH等报道了通过将人多能干细胞与小鼠来源的基质细胞(或称为滋 养层细胞)共培养而获得CD34阳性造血祖细胞的方法(Ledran MH et al.,2008)。

Yu C等报道了在化学成分明确的分化培养基中将人多能干细胞诱导分化为 CD34和CD45阳性造血祖细胞的方法(Yu C et al.,2010)。

然而上述方法获得的造血祖细胞仅具有向红系、髓系血液细胞分化的能力， 而不具有向淋巴系血液细胞(即T细胞、B细胞和NK细胞)分化的能力，因此不具 有重建整个造血系统的能力。

Kennedy M等在此基础上在无血清、无基质细胞的条件下获得了具有T细胞 分化能力的成熟型造血祖细胞，并证明成熟型造血祖细胞的获得需经过表面标志 物组合为CD34+CD43-的生血内皮(hemogenic endothelium,HE)阶段，而其功能 则可用T细胞分化能力进行评价(Kennedy M et al.,2013)。