[发明专利]一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒

权利要求书

1.一种快速检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的RPA扩增引物，其特征在于：

上游引物：

RPA-F：5’-AAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCAC-3’；

下游引物：

RPA-R：5’-Biotin-GCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATG-3’；

探针引物：

Probe：5’-FAM-TGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAA；

GCAAAG[THF]TAATCATCATCGCAC-P-3’。

2.一种检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：

包含权利要求1中的引物组和探针，含非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照样品和阴性对照样品；核酸扩增试剂盒和快速检测所用的试纸条；

所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，含有重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）及去离子水。

3.根据权利要求2所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒试剂盒的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1）权利要求1中的引物组和探针制备：

在高通量引物合成仪内合成，对合成的下游引物在5’段耦连上生物素，探针上游耦连FAM，中间位置采用THF（四氢呋喃）替代一个碱基，3’段进行磷酸化处理，引物组及探针均采用PAGE纯化并结合质谱方式对合成物进行检验；

2）核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，含有重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）及去离子水，为商品化制备；

3）快速检测所用试纸条：核酸扩增试剂盒检测所用试纸条含有生物素配体、抗FAM抗体及金颗粒；

4）所述非洲猪瘟病毒p72基因阳性对照样品和阴性对照样品均为临床检测获得的样品。

4.根据权利要求2所述的一种快速检测非洲猪瘟病毒试剂盒的检测方法，其特征在于包含以下步骤：

1）在RPA冻干酶粉中加入29.5μL水解缓冲液，2.1μL上游引物（10μM），2.1μL下游 (10μM)，0.6μL探针(10μM），12.2μL去离子水，1μL模板，在反应管盖上加2.5μL醋酸镁 (280mM)，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温38℃反应10min；

2）反应：将步骤1）恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，3-5min观察结果；

3）结果判读：直接肉眼判读

①阴性：仅在质控线有一条红色带，在检测线处无红色带出现，说明所检测的样本没有非洲猪瘟病毒感染；

②阳性：出现两条红色带，一条位于检测线处，另一条位于质控线处，证明所检测的样本为非洲猪瘟病毒感染；

③无效：质控线和检测线内均无红色条带出现，表明试验不成立，核酸试纸条失效。