[发明专利]一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种快速检测非洲猪瘟病毒RPA扩增引物及检测试剂盒，可有效扩增靶基因，特异性为100%，检测敏感性为10²拷贝/反应，灵敏度与TaqMan荧光定量PCR相当。与猪瘟病毒、猪疱疹病毒I型、猪繁殖与呼吸终合症病毒、猪圆环病毒等均无交叉反应。本发明的RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在38~46℃条件下均可实现靶基因的有效扩增，因此，本发明的试剂盒能快捷、高效、灵敏的检测非洲猪瘟病毒，具有操作简单，特异性高，且反应结果易于观察，安全无污染等特点，不仅为非洲猪瘟病毒感染核酸的现场快速检测筛查提供有效的技术手段，同时对于控制非洲猪瘟病毒在中国的感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有非常重要意义。

技术领域：

本发明涉及一种检测非洲猪瘟病毒核酸检测试剂盒，同时还提供了检测非洲猪瘟病毒的RPA扩增引物，属于预防兽医学检验领域。

背景技术：

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)感染引起的急性、热性、高度接触性烈性传染病，对养殖业的发展具有毁灭性打击，主要引起高热、呕吐、便秘，体表部分皮肤粉红色或紫色，剖检可见脾肿大，颜色变暗，质地变脆。

目前，用于非洲猪瘟病毒的检测方法主要包括PCR、荧光定量PCR等分子生物学方法，这些均需要昂贵的仪器设备且需要专业技术人员进行操作，难以满足非实验室等基层现场条件下的检测要求。

发明内容

本发明提供了一种用于检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作方法简单等优点。

本发明还提供了检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的扩增引物。

本发明所述的一种检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒，包含如下引物对、探针和核酸检测试纸条：其中，所述的引物组如下：

上游引物核苷酸信息：

RPA-F：5’-AAGAAGAAAGTTAATAGCAGATGCCGATACCAC-3’；

下游引物核苷酸信息：

RPA-R：5’-Biotin-GCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATG-3’；

探针Probe核苷酸信息：5’-FAM-TGGGTTGGTATTCCTCCCGTGGCTTCAAA

GCAAAG[THF]TAATCATCATCGCAC-P-3’

（Biotin：生物素基团，FAM：5-羧基荧光素基团，THF：四氢呋喃，P：磷酸基团，阻止扩增）。

所述的检测非洲猪瘟病毒RPA核酸试剂盒包含上述引物组合（引物及探针）、核酸扩增试剂盒和检测所用的试纸条；

所述的便携式检测试纸条为杭州优思达生物技术有限公司产品；

所述的核酸扩增试剂盒即重组酶聚合酶等温扩增试剂盒，购自英国TwistDX公司；试剂盒包括重组酶聚合酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液（280mM）和去离子水。

本发明所述的检测非洲猪瘟病毒的RPA核酸试纸条试剂盒的应用，包含以下步骤：

(1)配置RPA反应体系：在RPA冻干颗粒中加入29.5μL 水解缓冲液，2.1μL 10μM 上游引物，2.1μL 10μM下游引物，0.6μL 10μM探针，12.2μL 去离子水，1μL病毒基因组DNA模板，在反应管盖上加280mM醋酸镁溶液2.5μL，上下颠倒反应管使之充分混匀后离心；恒温反应；

(2)反应：将步骤(1)恒温反应后的产物用核酸检测试纸条检测，3-5min观察结果；