[发明专利]组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物的检测和相对定量方法

说明书

本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I‑DNA加合物的检测和相对定量方法，包括以下步骤：A、马兜铃酸I‑DNA加合物的制备和鉴定；B、将组织DNA进行酶解；C、采用步骤A制得的马兜铃酸I‑DNA加合物作为标准品，对步骤B获得的DNA酶解产物进行检测和相对定量。本发明可以用于检测马兜铃酸I处理的实验动物或疑似马兜铃酸I暴露的人的组织中的dA‑AL‑I。

技术领域

本发明涉及化学致癌物形成的DNA加合物的检测技术领域，是针对马兜铃酸I形成的DNA加合物(dA-AL-I)的检测和相对定量，具体涉及一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物的检测和相对定量方法。

背景技术

化学致癌物是引起癌症的主要原因之一，其中主要的作用方式是化学致癌物的代谢产物可以以共价键的形式结合在DNA上，形成DNA加合物，而DNA加合物会引起DNA断裂或突变，从而导致癌症的发生，例如黄曲霉素和马兜铃酸等就是通过这种方式引起癌症。另外，像这两种化学致癌物形成的DNA加合物可以长期存在与组织中。因此，对于DNA加合物的检测，不仅可以有助于揭示病因学，而且还可以判定是否有某种化学致癌物的暴露。

检测DNA加合物的方法主要包括免疫分析法、³²P后标记法和质谱法等。³²P后标记法具有非常高的灵敏度，可达1个加合物/10¹⁰个核苷酸，而且DNA用量最少，非常适用于有限的人类样本检测，但是该方法需要使用放射性同位素，而且操作费时和低产率。免疫分析法和质谱法的灵敏度为1个加合物/10⁸个核苷酸，需要的DNA也比³²P后标记法多。免疫分析法受限于特异识别DNA加合物的抗体。基于质谱(MS)的方法越来越多的用于检测和定量各种DNA加合物，而且MS也可以鉴定新加合物。MS通常与液相色谱(HPLC和UPLC)或气相色谱(GC)系统联用，将感兴趣的加合物从未被修饰的核苷酸或其他干扰损伤中分离出来。MS法具有最高的特异性而且可以获得结构信息，不足之处是需要加合物标准品。

据检索，现有技术中对于马兜铃酸I-DNA加合物的检测方法主要有：³²P后标记法和质谱法，另外还有报道通过荧光法来检测，如专利文献CN106198771A中公开了一种同时测定组织中两种马兜铃酸-DNA加合物的HPLC-FLD-DAD分析方法，其直接将组织中提取的DNA消化后，采用HPLC-FLD测定AA-DNA加合物、采用HPLC-DAD测定脱氧腺苷。但是该方法不够准确。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测和相对定量DNA中马兜铃酸I DNA加合物(dA-AL-I)的方法。本发明利用超高效液相色谱/三重四极杆质谱(UHPLC/QQQ MS)，以合成的dA-AL-I作为标准品，对组织中的dA-AL-I进行检测和相对定量。该方法有助于揭示病因学，还可以为判定是否有马兜铃酸I的暴露提供参考。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明提供了一种组织DNA中马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的检测和相对定量方法，包括以下步骤：

A、马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备和鉴定；

B、将组织DNA进行酶解；

C、采用步骤A制得的马兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)作为标准品，对步骤B获得的DNA酶解产物进行检测和相对定量。

优选地，步骤A中，所述兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)的制备步骤如下：将脱氧腺苷和马兜铃酸I溶于磷酸钾溶液中，加入锌粉，避光反应，即得兜铃酸I-DNA加合物(dA-AL-I)。

优选地，所述脱氧腺苷与磷酸钾溶液的固液比为2:1(g/ml)；所述马兜铃酸I与磷酸钾溶液的固液比为1:1(g/ml)；所述磷酸钾溶液的浓度为50mM，pH值为5.8。