[发明专利]一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法

说明书

本申请公开了一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法。包括以下步骤：表面消毒：筛选颗粒饱满的水稻种子，先用有效氯含量为1％的NaCLO漂洗，漂洗后收集种子，再用无菌水清洗；分离纯化：在培养基中培养内生细菌，采用30℃恒温培养箱培养，不定期观察出菌情况；挑选不同外观形态的单菌落，进行保存；鉴定：对所有分离出来的种子内生菌进行生物学特性分析：产铁载体功能定性检测、分泌IAA功能检测、溶磷功能检测、固氮功能和耐Cd性检测；同时对其进行分子生物学鉴定；筛选：通过对所有菌株的生物学特性检测的结果，选择其中综合生理功能优势的菌株作为优势菌进行保存。本方法能够从水稻种子中全面地筛选出降镉菌。

技术领域

本申请涉及细菌筛选技术领域，具体的说是一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法。

背景技术

水稻种子是内生细菌的重要载体，水稻植株不同部位中的内生细菌大部分都是通过种子遗传而来，对于水稻的生命活动起到了重要作用。相比于其他传统的微生物，与水稻植株有着先天性的紧密联系，能够“和谐联合”的共生，因此水稻种子是研究内生细菌抑制水稻镉吸收能力的理想对象。

其次，分析水稻种子中具有潜在抑制水稻镉吸收能力的内生细菌多样性能够起到有效指导作用，有助于筛选出更加高效的功能菌株。

最后，之前关于水稻镉吸收能力的研究大多关注微生物的直接作用效果，或是微生物的使用方法。但是由于微生物对环境条件敏感，定殖能力差，作用效果不稳定，所以在实际应用中不能很好的发挥效果。外加微生物和水稻内生菌群落作为一个相互作用的体系，关于系统中微生物群落的变化却鲜有报道。本研究将探究水稻内生细菌群落多样性和组成的变化，联系水稻镉吸收能力的变化，揭示内生细菌的作用机制，对于实际的农业应用有着重要的指导意义。

在细菌的筛选方法中，根据细菌体积大小来离心分离细菌，可以快速筛选出所需细菌，但很多细菌分离装置只有一个离心网，离心网的孔径大小不变，不能进行调节，每个细菌分离装置也只能筛选出同一种颗粒大小的细菌，细菌分离装置不能对细菌进行多级分离，不能满足对多种大小不同细菌的分离的要求，满足不了实验的需求，不利于对细菌多样化的实验研究。

鉴于此，本发明所述的一种降镉菌的筛选方法，有用选择培养基对细菌进行筛选，有通过细菌体积大小对细菌进行筛选，用三种培养基对细菌进行筛选，可以更加全面的保留种子里面的内生菌，采用多种标准进行鉴定，保证了筛选的高精度。

发明内容

本申请提供了一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法，采用三种培养基进行降镉菌筛选，同时采用多种筛选指标进行鉴定，提高了筛选精度，同时能够保证筛选细菌的全面性。

本发明提供一种从水稻种子中筛选降镉菌的筛选方法，包括以下步骤：

表面消毒：筛选颗粒饱满的水稻种子，先用有效氯含量为1％的NaCLO漂洗10分钟，漂洗后收集种子，再用无菌水清洗5次，每次1分钟；

种子研磨：根据研磨罐的容量，加入适量的水稻种子，将研磨罐放入适配器中，设置参数，启动研磨仪，研磨1-2分钟；

分离纯化：将所述种子研磨液涂布在培养基中，在培养基中培养内生细菌，采用30℃恒温培养箱培养，不定期观察出菌情况；挑选不同外观形态的单菌落，进行保存；

鉴定：对所有分离出来的种子内生菌进行生物学特性分析：产铁载体功能定性检测、分泌IAA功能检测、溶磷功能检测、固氮功能、耐Cd性检测和降镉功能检测；同时对其进行分子生物学鉴定；

筛选：通过对所有菌株的生物学特性检测的结果，选择其中综合生理功能合格的具有降镉功能的菌株作为优势菌进行保存。

进一步地，所述步骤分离纯化中，采用R2A、1/2LB和1/2PDA三种种培养基培养内生细菌，将种子研磨液涂布在R2A、1/2LB和1/2PDA三种平板培养基上。