[发明专利]猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白及其多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

<1>PEDV S2A基因片段的扩增

对PEDV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物S2A-P1和S2A-P2对PEDV S2A基因进行PCR扩增，所述特异性引物S2A-P1和S2A-P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；

<2>原核表达质粒pET32a-S2A的构建

将PCR扩增得到的PEDV S2A基因片段连接pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18-S2A克隆质粒；将pMD18-S2A克隆质粒和pET-32a(+)分别进行双酶切，回收S2A基因和pET-32a(+)载体，利用T4连接酶将pET-32a(+)和S2A基因连接过夜后转化到DH5α感受态细胞后提取质粒得到原核表达质粒pET32a-S2A；

<3>重组S2蛋白的获取

将原核表达质粒pET32a-S2A转化BL21感受态细胞，加入IPTG诱导，菌液超声波裂解，离心，收集上清和沉淀，SDS-PAGE电泳确定重组S2蛋白主要在上清中表达，按照康为世纪公司His标签蛋白纯化试剂盒的纯化方法获得重组S2蛋白。

2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于步骤<1>中：PCR扩增的反应体系和反应条件为：反应体系：Taq Mix12.5μL，灭菌ddH₂O 9μL，上下游引物S2A-P1、S2A-P2各0.5μL，cDNA 2.5μL；反应条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，34个循环；最后72℃延伸5min。

3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：将PCR产物电泳后进行胶回收纯化，得到PEDV S2A基因片段，连接pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞，涂板于含有Amp的LB平板上培养过夜，挑取单个菌落接种于含有Amp的LB液体培养基中震荡10-12小时，抽提获得pMD18-S2A克隆质粒。

4.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：将pET-32a(+)空载体和克隆质粒pMD18-S2A分别用BamHⅠ和XholⅠ进行双酶切，分别胶回收pET-32a(+)空载体和目的基因S2A；利用T4连接酶将pET-32a(+)和S2A以1:3的比例连接过夜，转化DH5α感受态细胞进行克隆；抽提质粒并用BamHⅠ和XholⅠ进行双酶切鉴定，获得正确的原核表达质粒pET32a-S2A。

5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，其特征在于步骤<3>按以下操作进行：将原核表达质粒pET32a-S2A转化BL21感受态细胞；将重组菌培养至OD_600nm 0.6-0.8时，加入IPTG诱导；将经SDS-PAGE电泳确定重组蛋白得到表达的菌液用超声波裂解，裂解后12000rpm离心10分钟，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，按照康为世纪公司His标签蛋白纯化试剂盒的纯化方法获得重组PEDV S2蛋白。

6.使用权利要求1所述猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白制备多克隆抗体的方法，其特征在于使用猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清。

7.根据权利要求6所述的制备多克隆抗体的方法，其特征在于所述猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白与弗氏佐剂乳化按以下操作进行：将纯化得到的重组PEDV S2蛋白加入透析袋中透析，再用PEG-20000进行包埋，将蛋白适当浓缩并测定蛋白浓度；用乳化器将浓缩后的蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂进行混合乳化，至不分层时即为一免用的蛋白抗原；二免、三免时取浓缩蛋白溶液与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化作为二免、三免用蛋白抗原。

8.根据权利要求6所述的制备多克隆抗体的方法，其特征在于所述免疫动物按以下操作进行：

1)首免：将蛋白溶液与等体积弗氏完全佐剂混匀乳化，静置30分钟不分层时用于小鼠免疫；实验组免疫重组蛋白剂量为200μg/只，对照组免疫等体积的弗氏完全佐剂与PBS的混合液；

2)二免：两周后进行二免，二免时用蛋白溶液和等体积弗氏不完全佐剂的混匀乳化，免疫用抗原的剂量同首免；三免方案同二免；

3)三免后两周断尾采血，分离血清。