[发明专利]猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白及其多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，该法对PEDV S2A基因片段进行扩增后经过原核表达、纯化后获得重组S2蛋白。据此，发明人还建立了重组S2蛋白多克隆抗体的制备方法，即应用猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白与弗氏佐剂乳化后免疫动物获得多克隆抗体血清。实验表明，本发明成功扩增了PEDV流行变异毒株CH/GX/2015/750A S2基因部分抗原性强的区域，并进行原核表达，初步研究其反应原性和免疫原性，为下一步开展S2蛋白的功能研究以及为诊断试剂盒或亚单位疫苗的研发奠定了基础。

技术领域

本发明属于猪流行性腹泻病毒技术领域，尤其涉及一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白及其多克隆抗体的制备方法。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea Virus,PEDV)引起的一种高度接触性的急性传染病，以粪口途径传播为主，感染猪会出现呕吐、水样腹泻、脱水等症状，乳猪会出现脱水、酸中毒死亡，猪只年龄越小死亡率越高。猪流行性腹泻病最初于20世纪70年代报道于英国和比利时，随后包括中国、菲律宾、韩国等在内的多个亚洲国家也先后报道本病的发生。2010年底开始，我国多个省市或地区陆续报道PED大规模暴发，且免疫过流行性腹泻疫苗的规模化猪场也爆发了PED，新生仔猪大量死亡，损失惨重。美洲于2013年也首次暴发PED，后证实是病毒的变异导致PEDV在美洲国家和地区的大流行，给养猪业造成了巨大的经济损失。

猪流行性腹泻病毒(PEDV)是单链正股RNA病毒，在遗传分类上属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属。PEDV基因组共编码4种主要结构蛋白，即核衣壳蛋白(N)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和纤突蛋白(S)。S蛋白位于病毒粒子表面，由1383个氨基酸组成，分为两个功能区即S1(1～789aa)和S2(790～1 383aa)，S蛋白在介导病毒粒子进入细胞和诱导机体产生中和抗体的过程中起到关键作用。我国2010年底以后，从发病猪肠道或粪便中分离到的PEDV流行毒株主要为变异毒株，其与经典疫苗株CV777相比，在S基因上有很多的变异，这可能使病毒毒力增强或者改变了病毒的免疫逃避机制，促使PED在中国的大暴发。Sun等报道，S1蛋白636～789aa是一段高度保守的区域，能够诱导机体产生中和抗体。孙东波使用丝状噬菌体展示系统鉴定出S蛋白的S1区域具有5个线性抗原表位区域和1个中和表位。桂锐等原核表达了PEDV部分S1蛋白(60-845bp)，重组蛋白得到了表达且具有良好的反应原性，能够被兔PEDV多抗血清识别。前述研究主要针对PEDV S蛋白S1区域功能，而对PEDV S蛋白S2区域的抗原性等功能研究较少。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白及其多克隆抗体的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

猪流行性腹泻病毒重组S2蛋白的制备方法，包括以下步骤：

<1>PEDV S2A基因片段的扩增

对PEDV的RNA进行反转录获得cDNA，然后采用特异性引物S2A-P1和S2A-P2对PEDVS2A基因进行PCR扩增，特异性引物S2A-P1和S2A-P2分别具有序列表SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2的碱基序列；

<2>原核表达质粒pET32a-S2A的构建

将PCR扩增得到的PEDV S2A基因片段连接pMD18-T克隆载体，转化DH5α感受态细胞获得pMD18-S2A克隆质粒；将pMD18-S2A克隆质粒和pET-32a(+)分别进行双酶切，回收S2A基因和pET-32a(+)载体，利用T4连接酶将pET-32a(+)和S2A基因连接过夜后转化到DH5α感受态细胞后提取质粒得到原核表达质粒pET32a-S2A；

<3>重组S2蛋白的获取