[发明专利]鸡滑液囊支原体培养液效价的测定方法

说明书

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其是一种鸡滑液囊支原体培养液效价的测定方法，通过用SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测鸡滑液囊支原体新鲜培养液中的支原体粒子数来计算鸡滑液囊支原体培养液变色单位。包括以下步骤：(1)取样；(2)测定：荧光定量方法测定CP值；(3)计算：按照以下公式计算鸡滑液囊支原体培养液变色单位，变色单位(Log10)(CCU/ml)＝0.2001*Ln(CP值)+3.7777。该方法检测时间短，并且操作简单，缩短了鸡滑液囊支原体培养液效价的检测周期，适用范围广。

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，具体领域为一种鸡滑液囊支原体培养液效价的测定方法。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是鸡的一种急性或慢性传染病，以侵害关节的滑液囊膜及腱鞘为主，引起关节渗出性滑膜炎、腱鞘炎及跗关节和脚垫肿胀。鸡群感染该病可导致明显的跛行，生长发育迟缓及酮体降级等，并且与呼吸道疾病有关。当MS混合感染其它病毒或细菌，如鸡新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、低致病性禽流感病毒或大肠杆菌等，会使病情恶化。最新的流行病学调查显示，在东欧地区以及荷兰、墨西哥、阿根廷等国家MS感染可引起严重的呼吸系统疾病和关节滑膜炎；在我国，无论是商品肉鸡、蛋鸡或种鸡，MS的发病率呈现上升趋势，加上环境及鸡群状态不良等不利因素，MS感染在鸡群种爆发的现象日趋严重，给养鸡业造成巨大的经济损失。

由于鸡滑液囊支原体给养鸡业带来严重的经济损失，有关鸡滑液囊支原体的研究引起了越来越多的关注。其中鸡滑液囊支原体的培养液效价的测定是鸡滑液囊支原体防治研究的基础，如研究鸡滑液囊支原体的致病剂量、培养条件、疫苗含菌量等等均离不开鸡滑液囊支原体培养液的效价测定。支原体培养液效价传统的测定方法是颜色变化单位法。

颜色变化单位法(CCU)是根据单位体积的支原体能使带有酚红指示剂的支原体培养液变色的最大稀释度，操作简单，不需要特殊仪器，测定时取一定容量的培养液作系列稀释，以培养物颜色变黄的最后1管为最终管(即1个变色单位)，最终变色的稀释度即支原体培养液效价。此法是一种检测支原体效价的好方法，但是费时，至少需要120小时才能出结果，无法满足检测时效性的需求。另外由于鸡滑液囊支原体培养比较困难，其培养条件较苛刻，增加了操作的复杂性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡滑液囊支原体培养液效价的测定方法，通过荧光定量PCR方法检测鸡滑液囊支原体培养液效价，替代传统的颜色变化单位法(CCU)，以达到快速准确、简单有效地检测出鸡滑液囊支原体培养液效价的目的。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种鸡滑液囊支原体培养液效价的测定方法，包括如下步骤：

(1)鸡滑液囊支原体培养；

(2)荧光定量PCR方法检测步骤1所得培养液中支原体荧光定量CP值；

(3)根据支原体粒子数CP值即拷贝/μL计算鸡滑液囊支原体培养液变色单位。

其中，所述步骤(1)具体为，将鸡滑液囊支原体接种鸡滑液囊支原体液体培养基中，37℃培养24～48h后，当培养液的颜色变黄、pH下降0.5以上时，无菌取出新鲜培养液；

其中，所述步骤(2)具体为，

①设计MS荧光定量PCR引物：上游引物：5’-GGAATTTTCCACAATGGGCGA-3’，下游引物5’-ACGCTTGCAACCTATGTATTA-3’，如SEQ ID:1-2所示；预期扩增片段大小为191bp；

②构建荧光定量PCR阳性标准品，所用的标准品含有目的片段的重组质粒pMD18-T；

③以②阳性标准品建立MS荧光定量PCR检测的标准曲线；