[发明专利]黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法

权利要求书

1.黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包含下列操作步骤：

(1)从感染柑橘黄龙病原体的柑橘总DNA中克隆获得柑橘黄龙病毒的表面抗原基因序列，然后对表面抗原基因序列进行氨基酸预分析：

(a)序列Blast比对，获得氨基酸信息；

(b)进行跨膜域分析；

(c)信号肽序列分析；

(d)无序序列分析；

(e)抗原性分析；

(f)同源性分析；

(2)抗原制备：根据上述分析得到的抗原序列，设计引物，构建大肠杆菌PET-28a的表达载体，构建完成后，诱导的实现分泌表达，破菌分离上清沉淀，取上清液；,

(3)抗原蛋白纯化：首先采用金属螯合镍柱进行亲和层析，利用高亲和Ni-NTA纯化介质把螯合剂共价偶联到琼脂糖介质(4％交联)上，然后再与上清液螯合Ni²⁺进行纯化；

(4)抗体的制备：纯化后的抗原蛋白注射到两只免疫动物体内，加强免疫多次后，检测血清效价，血清效价达到要求后常规提取抗清血，将所得抗血清流过抗原免疫亲和填料，抗血清中的抗黄龙病抗体与偶联在抗原免疫亲和填料上黄龙病特异吸附，洗掉杂质，用弱酸洗脱，即得黄龙病胶体金多克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的免疫动物为日本大耳兔。

3.根据权利要求1所述的黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的抗原免疫亲和填料的制备方法包括以下步骤：

(a)取2g赖氨酸溶于10mL 0.1mol/L碳酸钠，充分溶解后加入到25mL过碘酸钠氧化的琼脂糖填料中混匀，60℃反应5min，摇匀再次反应10min，转4℃静置20min，然后加入硼氢化钠100mg混匀还原，室温摇床上摇动过夜，得到赖氨酸琼脂糖填料；

(b)将25mL的赖氨酸琼脂糖填料转移到50mL洁净的空柱子，用500mL蒸馏水漂洗；

(c)先用50mL 50％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再加入50mL 75％的冷丙酮洗1次，当溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，再次加入100mL100％冷丙酮洗1次；溶液即将完全进入赖氨酸琼脂糖填料层时，加入含有0.2mL三乙胺的20mL丙酮溶液，当溶液还剩1/3在赖氨酸琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠，即得到重悬好的赖氨酸琼脂糖填料；

(d)取现配的150mg NHS-碘乙酸活性酯，边振荡边加入至步骤(3)得到的重悬好的赖氨酸琼脂糖填料，盖紧，室温避光反应60min；

(e)去除赖氨酸琼脂糖填料中的液体，再用100mL 100％丙酮洗1次，当溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/L HCL的50mL 75％的冷丙酮洗1次，溶液即将完全进入琼脂糖珠层时，用含有0.1mol/L HCL的50mL 50％的冷丙酮洗1次，当溶液还剩1/3在琼脂糖填料层上时，反复震荡重悬琼脂糖珠；

(f)然后加入200mg的二硫苏糖醇，即得到巯基化琼脂糖填料；

(g)取1/2体积的活性黄龙病组分加入100uL饱和碳酸钠，然后和悬浮在丙酮的巯基琼脂糖珠填料室温反应过夜；

(h)用100mL丙酮清洗，再用400mL含0.05％吐温20的磷酸缓冲液PBSt清洗，即得到的抗原免疫亲和填料。