[发明专利]黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法

说明书

本发明公开了黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，包含下列操作步骤：(1)从感染柑橘黄龙病原体的柑橘总DNA中克隆获得柑橘黄龙病毒的表面抗原基因序列，然后对表面抗原基因序列进行氨基酸预分析；(2)抗原制备；(3)抗原蛋白纯化；(4)抗体的制备。本发明制成黄龙病胶体金多克隆抗体操作简单，方便使用，操作人员对技术要求不高，无需进行特殊培训；制成胶体金检测工序简单，短时间内能得出结果；制成胶体金后所用试剂毒性低，对环境污染小。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法。

背景技术

柑橘黄龙病是由一种仅在柑橘韧皮部内寄生的革兰氏阴性细菌引起的病，早期表现为叶产生1～2条黄梢，而后黄梢越来越多，至病株枯死。而目前未有有效的对黄龙病的防护和控制方法，若发现病株则需尽早对患病植株进行移除处理，因此黄龙病早期检测技术的研发具有重大意义。目前黄龙病的快速诊断与检测方法有6种，分别为田间症状诊断、指示植物鉴别、淀粉-碘反应诊断、高光谱成像无损检测、免疫学检测、分子检测。田间症状诊断主要是通过观察柑橘植株的叶子是否出现斑驳型黄化、红鼻子果实等症状判断柑橘是否患黄龙病，此判断方法准确度不高，易与其他病症混淆；指示植物鉴别即利用嫁接的方法把黄龙病病菌转移到对黄龙病病菌极其敏感的植物检测，此过程所需时间长，不能做到快速和早期检测；淀粉-碘反应诊断则是根据黄龙病致病特点(会引起植株韧皮部组织坏死和筛管堵死导致淀粉代谢异常，叶片大量积累淀粉)，直接观察叶片样品染色反应判断植株是否感染黄龙病病菌，此方法易因健康叶片上有淀粉干扰出现假阳性，灵敏度低；高光谱成像无损检测通过检测叶片表面及内部化学成分的变化诊断，但易造成误判；其他免疫学检测技术通过制备黄龙病病菌抗体，观察抗原抗体反应显色判断植株是否感染，此前的技术因孵育抗体费时，成本高而无法推广；分子检测技术主要为对样品进行核酸检测，利用PCR技术对核酸进行扩增检测，但此技术需要前期DNA模板的制备，费时、对人员技术有要求。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明针对目前现有免疫学检测技术成本高、操作复杂，不能做到高灵敏度的早期检测、不能做定量分析；分子检测技术需要前期DNA模板的制备，费时、对操作人员有技术要求，DNA提取所用溶剂对人体和环境有毒害的问题，发明一种黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，通过利用抗原抗体特异性结合这一特性检测黄龙病。胶体金——银标记免疫检测法，即用胶体金标记免疫血清或单克隆抗体，以硝酸银作染色剂，将柑桔叶子的叶脉徒手切片作材料，做定性分析，在6小时内完成检测。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

黄龙病胶体金多克隆抗体的制备方法，包含下列操作步骤：

(1)从感染柑橘黄龙病原体的柑橘总DNA中克隆获得柑橘黄龙病毒的表面抗原基因序列，然后对表面抗原基因序列进行氨基酸预分析：

(a)序列Blast比对，获得氨基酸信息；

(b)进行跨膜域分析；

(c)信号肽序列分析；

(d)无序序列分析；

(e)抗原性分析；

(f)同源性分析；

(2)抗原制备：根据上述分析得到的抗原序列，设计引物，构建大肠杆菌PET-28a的表达载体，构建完成后，诱导的实现分泌表达，破菌分离上清沉淀，取上清液；