[发明专利]一种心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备金纳米立方功能化的氧化石墨烯分散液；

（2）制备金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液；

（3）制备检测心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器；

（4）制作检测心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器的工作曲线；

上述步骤（1）制备金纳米立方功能化的氧化石墨烯分散液，步骤如下：

①金纳米立方分散液的制备

配制10 mL含0.25 mM氯金酸和75 mM十六烷基三甲基溴化铵的混合液于50 mL的圆底烧瓶中，在磁力搅拌下迅速加入0.5 ~ 0.7 mL、10 mM新配制的冰硼氢化钠溶液，于27 ℃水浴中搅拌3小时，制得金纳米粒子水溶胶；

量取1.0 mL上述制备的金纳米粒子水溶胶用超纯水稀释至100 mL作为金晶种分散液；

在50 mL离心管中依次加入0.1 mL、10 mM氯金酸溶液，2.0 mL、0.2 M十六烷基三甲基溴化铵溶液，1.5 mL、0.1 M抗坏血酸，0.3 ~ 0.5 mL上述制备的金晶种分散液，超纯水稀释至25 mL，在恒温振荡培养箱中于27 ℃振荡8小时，得到金纳米立方混合液；离心，超纯水洗涤3次，沉淀物重新分散于25 mL超纯水中，制得金纳米立方分散液；

②氧化石墨烯的制备

称取1.5 ~ 2.5 g石墨粉，在搅拌下加入96 mL浓硫酸，反应20分钟后加入10 ~ 14 g高锰酸钾，在冰水浴下搅拌1.5小时，加热至55 ℃反应5小时，依次缓慢加入100 mL超纯水和10 mL双氧水，搅拌30分钟后离心分离，在冷冻干燥机中于-50 ℃冻干12小时，制得氧化石墨烯；

③金纳米立方功能化的氧化石墨烯分散液的制备

称取10 ~ 20 mg氧化石墨烯加入20 mL上述制备的金纳米立方分散液中，在室温下超声2小时，离心分离，制得金纳米立方功能化的氧化石墨烯分散液；

上述步骤（2）制备金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液，步骤如下：

①金银核壳纳米立方分散液的制备

根据上述步骤①金纳米立方分散液的制备步骤制备25 mL金纳米立方分散液，后依次加入1.0 ~ 3.0 mL、0.1 M新配制的抗坏血酸和1.0 mL、10 mM硝酸银，于60 ℃的水浴中反应12小时；用体积比为3：1的超纯水与丙酮的混合液离心洗涤3次，所得沉淀物重新分散在20 mL超纯水中，制得金银核壳纳米立方分散液；

②氮硫双掺杂氧化石墨烯的制备

称取15 ~ 25 mg氧化石墨烯加入20 mL超纯水中，超声分散，加入20 ~ 40 mg硫脲，超声5分钟，转移到高压反应釜中，于180 ℃反应12小时；自然冷却至室温，超纯水洗涤至中性，在冷冻干燥机中于-50 ℃冻干8小时，制得氮硫双掺杂氧化石墨烯；

③金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯的制备

称取10 ~ 20 mg上述制备的氮硫双掺杂氧化石墨烯，分散在20 mL金银核壳纳米立方分散液中，在室温下振荡6小时，离心分离，在高温鼓风干燥箱中于40 ℃烘干12小时，制得金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯；

④金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液的制备

称取3.0 ~ 7.0 mg金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯分散到1.0 mL超纯水中，加入100 µL、80 ~ 120 µg/mL心肌肌钙蛋白检测抗体溶液和900 µL、50 mM、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液，于恒温振荡培养箱中4 ℃下振荡孵化12小时，离心分离，将下层沉淀再分散到2.0 mL、50 mM、pH为7.2的磷酸盐缓冲溶液中，制得金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液，4 ℃下保存备用；

上述步骤（3）制备检测心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器，步骤如下：

①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al₂O₃抛光粉打磨，超纯水清洗干净；

② 取6.0 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的金纳米立方功能化的氧化石墨烯分散液滴涂到电极表面，室温下晾干，超纯水冲洗电极表面，晾干；

③ 将6.0 µL、8.0 ~ 12 µg/mL的心肌肌钙蛋白捕获抗体Ab₁滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱中晾干；

④ 继续将3.0 µL、0.8 ~ 1.2 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑤ 滴加6.0 µL、0.0001 ~ 200 ng/mL的一系列不同浓度的心肌肌钙蛋白抗原Ag溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干；

⑥ 将6.0 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL金银核壳纳米立方功能化的氮硫双掺杂氧化石墨烯标记检测抗体分散液滴至电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40分钟，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱中晾干，制得检测心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器；

上述步骤（4）制作检测心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器的工作曲线，步骤如下：

① 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL包含5.0 mM过氧化氢溶液、2.0 mM邻苯二胺溶液、pH为5.5 ~ 8.5的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；

② 采用差分脉冲伏安法对分析物进行检测，初始电位为0.15 V，终止电位为0.50 V，脉冲振幅为50 mV，脉冲宽度为50 ms，脉冲周期为500 ms，记录电流变化；

②记录不同浓度下心肌肌钙蛋白所对应的电流峰值，绘制工作曲线；

③利用工作曲线法，得到待测样品中心肌肌钙蛋白抗原的浓度。

2.如权利要求1所述的一种心肌肌钙蛋白的夹心型电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述心肌肌钙蛋白为cTnI。