[发明专利]一种近红外荧光蛋白smURFP及直接检测胆绿素的方法

说明书

本发明公开一种近红外荧光蛋白smURFP基因序列以及一种直接检测胆绿素的方法。本发明利用近红外荧光蛋白smURFP与样品中的胆绿素进行共价结合，经642nm激发光激发后通过酶标仪检测器670nm处发射光强度来直接对胆绿素进行定量检测，从而简化了已有的检测手段的操作，避免了成本较高操作要求较苛刻的仪器的使用，同时提高了对胆绿素检测的灵敏性，具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种近红外荧光蛋白smURFP及直接检测胆绿素的方法。

背景技术

胆绿素(BV)是一种是人体内天然存在的绿色小分子物质，是正常体内代谢过程中血红素氧化酶(Heme Oxygenase,HO)降解血红素的终末代谢产物，是胆汁及黄胆尿中的主要胆汁色素，可由胆红素氧化而得，通常经过肝脏中的胆绿素还原酶还原成胆红素后有肝脏排入血液中。在正常人体血液中胆绿素的含量极低，而患有肝脏疾病者的血液中胆绿素含量比正常水平高。

目前测定血清胆绿素的方法主要有间接检测的方法和基于高效液相色谱(HPLC)的直接检测的方法。其中，间接测定胆绿素的主要策略是将胆绿素通过化学手段还原成胆红素测定，或者通过胆绿素还原酶与胆绿素作用后溶液吸收光波长的变化来测定胆绿素。间接法由于需要对胆绿素进行还原处理，因此其检测操作复杂，并且测定结果在很大程度上受其所使用的还原剂或酶的活性以及对胆绿素的还原程度的影响。此外，再利用化学手段对胆绿素进行还原处理时，要确保无副反应发生或副反应对最后的测定结果没有影响。从而还原剂的选择以及反应的时间要通过严格控制来排除干扰。

基于高效液相色谱(HPLC)检测胆绿素的方法，其使用高效液相色谱仪的操作要求较高，对样品的处理要求较高，并且仪器的使用成本也较高，从而导致这种方法的检测成本较高。

近红外荧光蛋白是一种其激发光与发射光波长处于近红外波长范围的荧光蛋白，由于其较长的激发波长与发射波长，近红外荧光蛋白在应用中有利于排除被测样品中自身荧光信号的干扰，从而在成像以及家呢领域中具有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供了近红外荧光蛋白smURFP及直接检测胆绿素的方法,该方法抗干扰性强、准确度高、并且能够直接检测胆绿素。

本发明的第一个技术方案：一种近红外荧光蛋白smURFP，基因序列为SEQ ID NO：1。

本发明的第二个技术方案：一种直接检测胆绿素的方法，包括以下步骤：

1)化学合成近红外荧光蛋白smURFP基因，并将近红外荧光蛋白smURFP在宿主细胞中进行大量表达；

2)分离纯化得到纯度>90％的近红外荧光蛋白smURFP溶液，并使用缓冲液将蛋白溶液稀释成所需浓度；

3)将50μl蛋白溶液与50μl含有胆绿素样品的溶液混匀后孵育；

4)使用酶标仪在激发光激发下检测发射光的荧光强度；

5)根据标准曲线计算所测样品的胆绿素含量。

所述步骤1)中构建含有SEQ ID NO.1基因序列的原核表达载体，转入大肠杆菌E.coli细胞，表达近红外荧光蛋白smURFP。

所述步骤2)中采用Ni-亲和层析、阴离子交换层析和分子筛层析分离纯化得到近红外荧光蛋白smURFP。

所述步骤2)中缓冲液体系包括：pH为8.0、9.4、11.0的50mM Tris-HCL和PBS。

所述步骤2)中缓冲液盐浓度包括：0mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM、900mM、1000mM Nacl。