[发明专利]一种快速检测丛植菌根真菌成功侵染寄主的方法

权利要求书

1.一种快速检测丛植菌根真菌侵染寄主的方法，其特征在于，该方法以fadD28作为成功侵染的分子标记；所述方法通过检测植物根系中的fadD28基因的表达水平来判断丛植菌根真菌是否成功侵染植物根系，当fadD28基因的表达水平显著增加时，表示侵染成功；

所述植物为花生、大豆、玉米或水稻；

具体包括以下步骤：

（1）丛枝菌根真菌利用高粱进行繁殖，待高粱生长至4个月时取根系土充分混匀后备用；

（2）取种植过作物的土壤进行高温高压灭菌2次，中间间隔24h，然后室温放置一周，得已灭菌的土壤备用，将作物种子用70%的酒精进行表面消毒2分钟，用无菌水冲洗数次，放在25℃的保温箱内进行发芽，待种子萌发后放入已灭菌的土壤中，种子周围撒入含有摩西球囊霉（Glomus mosseae）孢子的菌土10g，另外，对照处理为等量的高温高压灭菌的菌土；

（3）出苗后30天，取植株根系进行RNA提取，去除基因组DNA，cDNA第一链合成，设计荧光定量引物进行荧光定量PCR；

（4）利用公式△△Ct =试验样品△Ct-对照样品△Ct，试验样品△Ct =试验样品目的基因Ct -试验样品内参基因Ct，对照样品△Ct =对照样品目的基因Ct-对照样品内参基因Ct，进行计算mRNA的相对表达差异。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述丛枝菌根真菌利用高粱进行繁殖的具体方法为：沸沙培养基质经两次连续高温高压灭菌1h后室温放置5天，然后装灭菌的沸沙培养基质至塑料钵的2/3，将丛枝菌根真菌均匀平铺在基质上，再覆灭菌基质2厘米，浇水，播种高粱种子15-20粒/钵，覆盖1厘米灭菌基质，移至光照室内培养4个月。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述10g菌土中含有300-350个摩西球囊霉（Glomus mosseae）孢子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述RNA提取的方法如下：

（1）把1 ml Trizol试剂加入到50-100mg经液氮充分研磨的根系组织材料中，涡旋5min；

（2）在4℃，12000rpm转速下离心10min，把上清液转入到新的2ml离心管中，室温放置5min；

（3）加入200µl氯仿轻轻震荡混匀15s后室温放置2-3min，转速12000rpm，4℃离心15min；

（4）吸取上层水相到新的1.5 ml离心管中，加入0.5体积的异丙醇，室温放置10 min；转速12000，4℃离心10min，弃除上清，RNA沉于管底，用1ml 75%乙醇洗涤2次；转速7500 rpm，4℃离心5 min，弃上清液，室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10 min；

（5）用50-100 µl不含RNase的ddH₂O溶解沉淀，把溶解的RNA放入55-60℃的水中，水浴5-10 min；跑1%的琼脂糖胶检测RNA的完整性；

所述去除基因组DNA的具体步骤为：总RNA经DNase I去除残留的DNA，按照产品说明书：1-2 µg总RNA中加入1 µl的10×reaction buffer with MgCl₂和1µl DNase I，加水补充至10 µl后，离心混匀，37℃反应30min后，加入1 µl的50mM EDTA，于65℃下10 min使DNase I失活；

所述cDNA第一链合成的步骤为：

（1）电泳检测RNA是否降解，并用RNA/DNA calculator测定OD值，计算RNA浓度；

（2）取2 µg总RNA，加DEPC处理的ddH₂O至9.5 µL；70 ℃变性5 min，冰浴中放置5 min，然后离心；

（3）按下表在冰浴中依次加入各种成分，轻轻混匀，然后离心；

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（4）42 ℃下温浴60 min；70 ℃加热10 min灭活反转录酶；加入180 µL 经DEPC处理的ddH₂O，稀释至200 µL，-20 ℃保存。