[发明专利]一株生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌

说明书

本发明公开了一株生产D‑对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌。本发明提供了重组菌，为共表达海因酶编码基因和N‑氨甲酰水解酶编码基因的枯草芽孢杆菌。本发明通过表达经过密码子优化的来源于Bacillus stearothermophilus SD‑1的D‑海因酶基因和来源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291的N‑氨甲酰水解酶基因，更换P_cry3A启动子，成功构建出了一株可催化生产D‑对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌菌株，通过加入不同浓度甲苯溶液，发现细胞壁通透性为限制催化反应的主要因素，为后续实验提供基础。其中加入甲苯浓度为0.2％时，可使产量稳定提高约39.6％。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一株生产D-对羟基苯甘氨酸的枯草芽孢杆菌。

背景技术

具有光学活性的D-氨基酸是医药、化妆品和食品的重要原料，广泛用作半合成抗生素、肽类激素和拟除虫菊酯等杀虫剂的中间体。其中D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)主要用于半合成β-内酰胺类抗生素，如头孢氨苄、头孢羟基卞、阿莫西林(羟氨苄青霉素)等，在临床上的应用十分广泛。因此D-对羟基苯甘氨酸在抗生素工业中具有重要价值。

由于化学法在进行去氨基甲酰化生产中具有产率低和产生大量废物等问题，因此越来越多的关注点集中在生物酶法催化。生物转化生成D-对羟基苯甘氨酸主要由海因酶、N-氨甲酰水解酶联合催化。

以E.coli为宿主催化D-对羟基苯甘氨酸的生产仍存在许多不利因素，如共表达N-氨甲酰水解酶易形成包涵体，加大酶活性的不平衡等问题，因此急需更有利于该酶表达的宿主，而枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)其基因操作水平成熟，作为GRAS(GenerallyRecognized as Safe)等级菌株，有长期制备发酵食品的历史，可尝试来克服E.coli的缺陷。

发明内容

为了以枯草芽孢杆菌为宿主催化D-对羟基苯甘氨酸的生产，本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌，为共表达海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的枯草芽孢杆菌。

上述重组菌中，所述海因酶编码基因源于Bacillus stearothermophilus SD-1，且进行2个位点的突变M63I和F159S，具体基因编码的氨基酸序列为序列2；

所述N-氨甲酰水解酶编码基因源于Agrobacterium tumefaciens NRRL B11291；

和/或，所述海因酶的氨基酸序列为序列2；

所述N-氨甲酰水解酶的氨基酸序列为序列4；

和/或，所述海因酶编码基因的核苷酸序列为序列1；

所述N-氨甲酰水解酶编码基因的核苷酸序列为序列3。

上述重组菌中，所述海因酶编码基因紧邻启动海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因共表达的启动子(顺序为启动子、海因酶编码基因、N-氨甲酰水解酶编码基因)。

上述重组菌中，所述重组菌中，启动所述海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因表达的启动子为P_cry3A；

和/或，所述枯草芽孢杆菌WB600。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组菌的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中，得到重组菌。

上述方法中，所述将含有海因酶编码基因和N-氨甲酰水解酶编码基因的融合基因片段及其启动子导入枯草芽孢杆菌中为将所述融合基因片段及其启动子通过重组载体导入所述枯草芽孢杆菌；