[发明专利]一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的方法及其专用培养基

说明书

本发明公开了一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋白质的专用培养基。本发明提供的用于SILAC标记的培养基，由无机盐、组氨酸盐酸盐、异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、重稳定性同位素标记赖氨酸、重稳定性同位素标记精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、腺嘌呤硫酸盐、尿嘧啶和葡萄糖组成；所述无机盐为硫酸铵、柠檬酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、柠檬酸铁铵、硫酸镁、氯化钙、硫酸锌和硫酸铜。经过实验证明，本发明开发的一种用于耻垢分枝杆菌SILAC标记的培养基，可以在10代内高效标记耻垢分枝杆菌蛋白，为定量内标的制备和高效精确地定量蛋白质组比较研究创造了条件。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种利用SILAC标记耻垢分枝杆菌蛋 白质组的方法及其专用培养基。

背景技术

结核病(Tuberculosis,TB)是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，其流行范围广、危害程度高，是伴随人类历史最长、造成死亡人数最多的一类传染病。2016 年，全球新发结核病例1040万，死亡人数超过180万，其中约三分之一是HIV 阳性患者。在我国，每年新增病人约130万，死亡人数20万，形势也非常严峻。 而耐药性菌株的出现速度有加快的趋势，更是加剧了结核病防诊治的难度。加 强对结核致病菌的研究有着重要的临床价值，但结核分枝杆菌属于慢速生长型 分枝杆菌，菌落形成要4-5周，且实验需要在P3实验室进行，研究成本较高。

耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)是放线菌门(Actinobacteria)、 分枝杆菌属(Mycobacterium)中的抗酸细菌，具有3.0-5.0μm长的杆状形状， 并且可以通过Ziehl-Neelsen方法和金胺-罗丹明荧光法染色，是一种快生长、非 致病性分枝杆菌，于1884年由Lustgarten首次发现和分离，并于1899年由莱曼 和诺伊曼正式命名。

耻垢分枝杆菌主要存在于土壤、水和植物中，已在美国、澳大利亚、俄罗 斯、加拿大和瑞士等多个国家发现了分离株。在大多数情况下，耻垢分枝杆菌 通常是安全不致病的。与致病分枝杆菌相比，耻垢分枝杆菌仅需要生物安全性1 级实验室，易于在大多数实验室常用培养基中培养，且具有生长快速的特点， 在3-5天内即可形成肉眼可见的菌落。1990年分离得到的耻垢分枝杆菌MC²155 突变株具有极高的质粒转化效率，可以方便地进行遗传操作，构建特定的基因 失活和基因报告系统，因而得到了业界的重视。

耻垢分枝杆菌基因组已完成测序，长度为6,988,209个核苷酸，具有67％的 鸟嘌呤和胞嘧啶含量以及33％的腺嘌呤和胸腺嘧啶含量。耻垢分枝杆菌与结核 分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)具有相同的特殊细胞壁结构，且共有2000 多个同源基因，占其编码基因总数的近50％，适于据此调查结核分枝杆菌特定 基因的生物学功能。因此耻垢分枝杆菌是研究结核分枝杆菌和其他病原分枝杆 菌的重要模式生物。此外，耻垢分枝杆菌木糖的转化效率达70％，因此该菌还 可用于发酵法生产食品工业的重要添加剂木糖醇。

蛋白质是基因功能的直接执行者，且相互关联，共同完成细胞复杂的生命 活动过程。蛋白质组学是系统鉴定和定量细胞内蛋白质，并研究其功能的新兴 学科。对耻垢分枝杆菌开展蛋白质组学、特别是定量蛋白质组学研究，发现、 鉴别不同条件相关的关键差异蛋白，不仅可以揭示其分子调控网络及其分子机 制，还可为探索结核分枝杆菌感染及耐药发生的机理提供线索，为新的结核病 预防和治疗技术研发创造条件。