[发明专利]一种胚胎的玻璃化冷冻和解冻方法

说明书

本发明公开了一种胚胎的玻璃化冷冻和解冻方法，属胚胎生物技术领域。技术方案包括：将冷冻液和解冻液分段装入细管，每段液体用空气隔开，其中一段冷冻液中置入了胚胎，后封口细管、投入液氮，特征是，装入细管内的冷冻液和解冻液各有两段，冷冻液与解冻液的体积比小于或等于1∶5，或混合后混合液中抗冻保护剂的浓度在2.0Mol/L以内。本发明的简易解冻和移植法为，在室温下，将冷冻保存胚胎的细管由液氮中取出，空气浴4~6s，20~25℃水浴，取出细管，来回颠倒甩动细管，使冷冻液混合均匀，即移植胚胎。本发明极大地简化了胚胎玻璃化冷冻后的解冻程序，实现了胚胎在管内脱毒、直接移植，简易方便，可操作性强，利于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种玻璃化胚胎冷冻、解冻和直接移植方法，特别是用于哺乳动物的胚胎冷冻、解冻和移植方法，属胚胎生物技术领域

背景技术

1972年Whittingham首次采用二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide： DMSO)为主体抗冻保护剂冷冻保存小鼠的2～8-细胞胚胎获得成功， 并移植产下后代。他们所采用的冷冻液浓度为1.5Mol/L，使用程序 化降温冷冻仪。冷冻解冻后胚胎成活率为50％～70％，胚胎妊娠率为 65％，产仔率48％。程序化冷冻方法自发明以来，经各国研究者反复 试验，并对各种冷冻保护剂进行筛选，使胚胎冷冻解冻后存活率达到 90％以上，而冷冻程序基本不变，即：-6℃植冰后，以-0.33℃/min 的速率降至-30～-35℃，平衡后，再以-1.0℃/min的速度降至-80℃ 后投入液氮，整个过程约3个小时完成，到目前为止该方法仍被使用， 称之为常规冷冻法。

常规冷冻的程序复杂、耗时长、效率低，更不适于边远牧区的胚 胎冷冻保存和移植。为此，1985年Rall等发明胚胎玻璃化冷冻方法， 使冷冻勿需借助冷冻仪，可在室温下进行操作。程序得到极大地简化。 后经许多研究者的改进，目前胚胎的玻璃化冷冻方法仅需1分钟左 右即可完成一个程序。胚胎冷冻解冻后存活率95％以上，移植妊娠率 达60％～70％，产仔率平均为56％。产仔率比传统的程序化冷冻方法 提高了8％。

但是，由于玻璃化冷冻液浓度非常高(6Mol/L以上)，胚胎在玻 璃化冷冻液中的平衡时间一般不宜超过2分钟，即投入液氮中冷冻保 存。因此，对于玻璃化冷冻保存的胚胎，移植前必须将胚胎由冷冻细 管中推出，置于一定浓度(0.3～1.0Mol/L)的蔗糖溶液中5分钟左 右，以脱除抗冻保护剂，并在显微镜下回收胚胎，将胚胎重新装管后 再行移植。解冻过程不仅十分烦琐，且容易丢失胚胎，需要有操作熟 练的技术人员。这些条件都制约了玻璃化冷冻方法在生产中的推广应 用。

发明内容

本发明的目的是要提供一种胚胎的玻璃化冷冻、简易解冻和直接 移植法，以简化胚胎玻璃化冷冻方法的解冻步骤，为使玻璃化冷冻的 胚胎移植易于生产中推广应用。

为了达到本发明的目的所采取的技术方案包括以下胚胎的玻璃 化冷冻法：将冷冻液和解冻液分段装入细管内，每段液体之间都用一 段空气隔开，其中在一段冷冻液中置入了经过预处理液处理过的胚 胎，然后将细管封口、投入液氮，其特征在于，装入细管内的冷冻液 和解冻液各有两段，其装管顺序为：首先装入一段解冻液(6)，然后 装入一段空气(3)，接着装入一段冷冻液(5)，再装入一段空气(3)， 然后再装入一段冷冻液(4)，并在该段冷冻液中置入胚胎，接着再装 入一段空气(3)，最后在管端装入一段解冻液(2)并封闭管口；装 入细管内的冷冻液与解冻液地体积比值小于或等于1∶5。

上述的胚胎的玻璃化冷冻方法中，所述的冷冻液为EFS30，解冻 液为0.3～1Mol/L蔗糖溶液。

上述的胚胎的玻璃化冷冻法中，所述的装入细管中的第二段解冻 液(2)的长度为0.4～1.5cm，以0.5cm左右为宜。