[发明专利]一种检测结核分枝杆菌TB的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种检测结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，TB)的引物、试剂盒及检测方法，属于分子生物学领域；所述引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SED ID NO:2所示的反向引物组成；所述正向引物标记有生物素；所述反向引物标记有FITC或Dig；本发明采用重组酶‑多聚酶的核酸扩增技术与固相显色技术，仅需通过对临床样品进行DNA提取后等温扩增，不需要PCR仪进行热循环反应，检测结果肉眼可直接从固相显色试纸条上读取；本发明的引物检测结核分枝杆菌TB特异性强，扩增效率高；本发明的试剂盒及检测方法反应程序简单，可有效，快速地对结核分枝杆菌TB进行检测，适用于现场简便，快速，准确地进行人结核病的诊断。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种检测结核分枝杆菌TB的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

结核杆菌，即结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis，TB)是专性需氧微生物，它是人结核病的病原体。结核病是通过空气传播的传染病，主要传染途径是飞沫与空气传染，只有肺部结核病(肺结核)患者具有传染性，传染性患者咳嗽、打喷嚏、说话或吐痰时，产生带有结核杆菌的飞沫将结核杆菌排入空气，如果不小心吸入患者产生的飞沫，就有可能感染结核。全世界1/3的人都是结核杆菌感染者，但其中仅有5％-10％的人会在一生中发病。免疫系统会“阻隔”结核杆菌，而结核杆菌因外表有厚厚的蜡膜保护，可在人体内休眠多年。当人的免疫力减弱时，患病几率增加。如不治疗，每位活动性结核患者平均每年可感染10-15人。由于免疫系统能力减弱，艾滋病感染者感染后更易发生结核病。据世界卫生组织WHO报道，中国每年约有100万新发结核病患者，人数之多仅次于印度。因此结核病的防控对国家的公共卫生安全起着极为重要的作用，而控制结核病的传播关键在于早起诊断。

临床上患者常见的症状有咳嗽、胸痛、体重减轻、倦怠、食欲不振、发烧、咳血等。除这些症状，其他慢性胸腔疾病也会出现，故这些临床症状只能作为诊断上的参考。因此，要诊断结核病必须综合临床表现，加上放射学的变化以及实验室检验加以确认，才算完整。目前在国内结核分枝杆菌的培养仍然是结核菌检测和药敏试验(DST)的金标准。但传统的罗氏培养法耗时较长，约为4～6周，不能满足快速诊断的需要。液体培养系统如BACTEC和MGIT(BD Diagnostics,Sparks,Maryland,USA)提供了较传统固体培养更为敏感和快速的方法，1～3周可检测到分枝杆菌的生长。而针对结核分枝杆菌TB核酸的分子检测，主要为PCR法检测痰液中的结核分枝杆菌TB基因，此法专一性与灵敏度高，但时间需要至少60-90分钟，且需复杂仪器，并不适用于定点照护检测(point-of-care test；POCT)使用。因此，需要一种能够快速准确、简易、无须贵重仪器、可用于现场检测结核分枝杆菌TB的检测试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种检测结核分枝杆菌TB的引物、试剂盒及检验方法，解决现有技术中存在的结核分枝杆菌TB检测繁琐难以满足需求的问题。

基于重组酶-多聚酶的核酸扩增技术(Recombinase-polymerase amplification,RPA)模拟了细胞内核酸合成机制，在恒定温度范围内，借由重组酶、多聚酶及单链结合蛋白使DNA双链解旋，并促使特异性DNA片段扩增，以达到核酸体外扩增的效果。整个过程迅速(10-20分钟)且于低恒温(37-42℃)进行。目前对于RPA技术的研究尚处于起步阶段，本发明采用重组酶-多聚酶的核酸扩增技术并结合固相显色技术，提供一个简单、快速、不须昂贵设备即可现场进行结核分枝杆菌TB的筛检方式，具有高灵敏度、特异性的特点，适用于现场快速筛查。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

一种检测结核分枝杆菌TB的引物，所述引物由核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物和核苷酸序列如SED ID NO:2所示的反向引物组成；所述正向引物标记有生物素(Biotin)；所述反向引物标记有FITC或Dig。