[发明专利]一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法

权利要求书

1.一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，其特征在于，在N2B27+KSR的培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持人的胚胎干细胞的自我更新状态，人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。

2.一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，其特征在于，在DMEM培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持小鼠的胚胎干细胞的自我更新状态，小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。

3.根据权利要求1所述的应用方法，其特征在于，所述的人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：

（1）取一个6孔细胞培养板，每孔用2 ml DMEM+10 µl Matrigel包板，置于37℃、5% CO₂浓度的细胞培养箱内，包被4 h；

（2）取生长至70-80% 密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去细胞表面残留的培养液；

（3）加入1 ml CTK消化胚胎干细胞，6-8min后，细胞边缘浮起，弃CTK，加2 ml 含10%FBS的常规细胞培养液，用移液器吹打，将细胞从培养板上吹打下来，然后转移至15 ml 无菌离心管中；

（4）1200 rpm，离心4 min后，吸去上清；

（5）加2 ml含10%KSR的N2B27重悬细胞；

（6）在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；

（7）取已包被好的培养皿，弃包板溶液，PBS洗一遍，向培养板每孔内加入2 ml N2B27+KSR培养基；

（8）向培养基中加入5×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞均匀分布；

（9）加入10 µmol的CID755673小分子，水平十字形晃动，使其混合均匀；

（10）将细胞培养皿置于37℃、5% CO₂浓度的细胞培养箱内培养。

4.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述步骤（3）中的CTK含有1%Collagenase IV、0.25% Trypsin 、20% KSR、1mM CaCl₂的PBS。

5.根据权利要求3所述的应用方法，其特征在于，所述步骤（5）中的N2B27每5ml含有1.875 ml DMEM/F12，0.25 ml N2，1.875 ml Neurobasal medium，0.5 ml B27，2 mM L-glutamine，0.1 mM β- mercaptoethanol。

6.根据权利要求2所述的应用方法，其特征在于，所述的小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：

（1）取一个6 孔细胞培养板，每孔用2 ml Gelatin包板，置于37℃、5% CO₂浓度的细胞培养箱内，包被1 h；

（2）取生长密度55-65%的稳定的细胞系，弃培养液，PBS缓冲液小心洗涤1次，弃净残留洗涤液；

（3）立即加入1 ml胰酶消化液消化细胞，待数分钟后细胞集落边缘浮起，用微量移液器小心吹散并转移至含有2 ml DMEM血清培养液的15 ml 离心管中，继续小心吹打混匀，终止消化；

（4）将离心管中的混合悬液于1000 rpm离心约3 min，弃上清加入1 ml PBS缓冲液洗涤并再次离心；

（5）弃上清加入适量DMEM血清培养液重悬细胞，并进行细胞计数；

（6）取适量细胞悬液于15 ml 离心管，加入适量DMEM血清培养基至总体积2 ml，加入10µmol CID755673小分子，小心吹打混匀；

（7）取包被好的细胞培养皿，弃明胶，将上步的2 ml的悬液转移至培养皿，水平交叉十字法滑动，使细胞和小分子分布均匀；

（8）将细胞培养皿置于37℃、5% CO₂浓度的细胞培养箱内培养，每天观察细胞形态及生长状况，并隔天换培养液。

7.根据权利要求6所述的应用方法，其特征在于，加入CID755673和PD0325901两种小分子能够维持小鼠的胚胎干细胞维持长期的自我更新状态。