[发明专利]一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法

说明书

本发明公开了一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，包括人和小鼠的胚胎干细胞在本发明的这小分子状态下的传代和培养，以及本发明对细胞自我更新状态的观察与检测。本发明通过添加CID755673小分子解决了目前传统培养条件下小鼠与人胚胎干细胞状态易分化、传代操作复杂、培养条件成本高和不利于后续机制研究等问题，具有效果稳定、经济高效、操作简单、便于研究等优点，同时也为改善和建立其他种类和物种的多能干细胞的培养条件提供线索，对于未来干细胞基础与应用研究的顺利开展具有积极的推动作用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法。

背景技术

干细胞是一类来自胎儿、胚胎或成体内且在一定条件下具有无限的自我更新与增殖分化能力的一类细胞。一定条件下胚胎干细胞可被诱导分化为各种组织，这一特性使其在基础研究、移植治疗和基因治疗中具有诱人的应用前景，胚胎干细胞在体外适宜条件下，能够在未分化状态下无限增殖，这为胚胎干细胞进行的研究和应用提供了用之不竭的细胞来源。胚胎干细胞的这两种主要特性现已成为研究基因功能、筛选药物和制造疾病动物模型的强有力工具之一，在再生医学领域具有巨大的应用前景。目前研究得最为广泛的干细胞是小鼠胚胎干细胞（moµse Embryonic Stem Cells，mESCs），小鼠胚胎干细胞来源于着床前胚胎（怀孕第3.5天）的内细胞团具有发育的多能性，这也是第一株在体外成功建立的干细胞系。之后，人的胚胎干细胞（human Embryonic Stem Cells，hESCs）系也得以成功构建，hESCs是由人的早期胚胎内细胞团或hPGCs经过体外分化抑制培养，分离出来的多潜能细胞，有着极为广泛的应用前景。小鼠与人ESCs虽然拥有一些共同的特征，但二者的生物学特性却有诸多不同之处。CID755673小分子维持人和小鼠胚胎干细胞的自我更新状态，也避免了人和小鼠在培养过程中出现分化状态提供了一个新思路。其本身也是对于整个干细胞领域探究深度与广度的扩充，因而具有重要的科研价值与学术意义，相关成果有助于未来对于干细胞的安全应用。

人和小鼠的胚胎干细胞的维持需要特定的营养物质及细胞因子，若无这些细胞因子胚胎干细胞会出现分化现象 ，我们发现的CID755673化学小分子能够在不加入一些细胞因子的条件下促进胚胎干细胞的自我更新，而这可以作为胚胎干细胞的未来的培养条件，丰富了胚胎干细胞培养条件的种类，优化了胚胎干细胞的培养条件。

虽然优化后的CID755673培养条件可以维持胚胎干细胞的自我更新状态，但由于所涉及的细胞因子种类过多，不利于后续对于细胞内相关信号通路与分子机制的深入探究，且培养成本高。本发明在此基础上，通过逐个递减与对不同排列组合的尝试，进一步改进与优化人和小鼠的自我更新条件，优化后的条件仅使用两种小分子即可维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态，一类小分子即可促进人的胚胎的自我更新，达到与原培养条件相同的培养效果，具有省时、省力、省钱、利于后续研究等优点。

发明内容

本发明为了解决胚胎干细胞培养过程中出现易分化、传代操作不方便等问题，提供一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种促进胚胎干细胞自我更新状态的小分子的应用方法，在DMEM培养基、N2B27+KSR的培养基中，加入CID755673小分子化合物来维持小鼠和人的胚胎干细胞的自我更新状态，包括人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养和小鼠的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养。

所述的人的胚胎干细胞在CID755673条件下的传代和培养，包括以下步骤：

（1）取一个6孔细胞培养板，每孔用2 ml DMEM+10 µl Matrigel包板，置于37℃、5%CO₂浓度的细胞培养箱内，包被4 h；

（2）取生长至70-80% 密度的人的胚胎干细胞，弃培养液，用PBS洗涤细胞1次，除去细胞表面残留的培养液；