[发明专利]新型LL-D49194α1类似物，及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种酒红土褐链霉菌NRRL15735(Streptomyces vinaceusdrappus NRRL15735)的突变菌株，其特征在于，所述的突变菌种中，LL-D49194α1生物合成基因簇中选自下组的一个基因被失活敲除：细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10、糖基转移酶基因lldB3，或细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2；

其中，所述突变菌种通过以下制备方法制得，所述制备方法：构建同框敲除质粒，将带筛选抗性的质粒导入野生型菌株，通过质粒上带有的同源臂片段与野生型菌株基因组同源片段发生重组，从而从基因组中替代相应的细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10、糖基转移酶基因lldB3，或细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2，从而获得基因同框敲除或缺失的突变株；

其中，所述同源臂片段用以下正向引物和反向引物扩增获得：

(i)用于失活敲除细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10的引物

lldO10左臂正向引物：5’-ATAGAATTCACGAGGGTGCGGTCGTCT-3’

lldO10左臂反向引物：5’-ATATCTAGAATCGGCGACCAGGGCCTC-3’；

lldO10右臂正向引物：5’-ATATCTAGACAACGCCTGCCGGTCCGGTTC-3’

lldO10右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTACGTTCGCGCTGCCCCGGTTC-3’

(ii)用于失活敲除糖基转移酶基因lldB3的引物

lldB3左臂正向引物：5’-ATAGAATTCCCTGTTCCAGCTCCGCCTGG-3’

lldB3左臂反向引物：5’-ATATCTAGAACCCTGGAGAGGCTCACCGC-3’

lldB3右臂正向引物：5’-ATATCTAGAGTGAGCCTGGACGGGCCACA-3’

lldB3右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTGGAGCAGCCGCCTCATCAAG-3’

(iii)用于失活敲除细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2的引物

lldO2左臂正向引物：5’-ATAGAATTCCGCCGGCGTCTGCGGCCA-3’

lldO2左臂反向引物：5’-ATATCTAGAGGTGTCGACCTCAGTGGCCAT-3’

lldO2右臂正向引物：5’-ATATCTAGACCGGTCCGGATCCGCTGAC-3’

lldO2右臂反向引物：5’-ATAAAGCTTCGTGCCGGACGGCCCCGA-3’。

2.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，细胞色素P450氧化还原酶基因lldO10被失活敲除。

3.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，糖基转移酶基因lldB3被失活敲除。

4.如权利要求1所述的突变菌种，其特征在于，所述突变菌种中，细胞色素P450氧化还原酶基因lldO2被失活敲除。

5.一种制备LL-D49194α1类似物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)对权利要求1所述的突变菌种进行发酵，得到发酵产物；和

(b)从发酵产物中分离出所述的LL-D49194α1类似物，

和任选的步骤(c)将所述LL-D49194α1类似物转化为其药学上可接受的盐；

其中，所述LL-D49194α1类似物具有选自下组式Ia、Ib或Ic所示的结构：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵为液体摇瓶发酵。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的发酵包括：对所述菌株进行一级培养，得到发酵种子培养液，然后接种至发酵培养基中进行二级培养。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的二级培养还包括：菌株进入稳定生长期后，添加2％-3％大孔树脂HP20共培养并进行进一步发酵，从而获得LL-D49194α1类似物。