[发明专利]一种肺炎衣原体快速检测引物组、试剂盒

权利要求书

1.一种肺炎衣原体快速检测引物组，其特征在于，所述肺炎衣原体快速检测引物组包含检测肺炎衣原体基因组MOMP基因保守序列的上、下游引物和探针；所述上游引物是：5’-ACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGTT-3’；所述下游引物是：5’-CCTTTATAGCCCTTGGGTTTGTTTACAGA-3’；所述探针是5’-AAGTTCTTCAACTTTAGGTTTGGAC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCATATTGGA-3’C3 Spacer。

2.如权利要求1所述的肺炎衣原体快速检测引物组，其特征在于，所述上游引物可以是权利要求1所述上游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述下游引物可以是权利要求1所述下游引物序列的5’、3’端延伸或缩短10bp，所述探针可以是权利要求1所述探针序列的5’、3’端延伸或缩短10bp；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列同源性大于85％的序列；或者，所述上、下游引物和探针可以是分别与权利要求1所述上、下游引物和探针的序列碱基反向互补的序列；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于序列的第21-32位；或者，所述探针的6-FAM、缺失或BHQ1标记处于反向互补序列的第21-32位。

3.如权利要求1所述的肺炎衣原体快速检测引物组，其特征在于，所述探针长度有35bp，荧光、碱基缺失和淬灭修饰相邻，且处于序列中下游第26-28位。

4.如权利要求1、2或3所述的肺炎衣原体快速检测引物组应用于制备肺炎衣原体快速检测试剂盒。

5.一种肺炎衣原体快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下内容：

(1)裂解液；

(2)复溶液；

(3)含引物探针的EMA反应管；所述EMA反应管包含上、下游引物和探针，所述上游引物是：5’-ACTCTACAGCGTTCAATCTCGTTGGTT-3’；所述下游引物是：5’-CCTTTATAGCCCTTGGGTTTGTTTACAGA-3’；所述探针是5’-AAGTTCTTCAACTTTAGGTTTGGAC/i6-FAMdT//idSp//iBHQ1dT/GCATATTGGA-3’C3 Spacer；

(4)阳性质控品；

(5)阴性质控品。

6.如权利要求5所述的肺炎衣原体快速检测试剂盒，其特征在于，所述裂解液含有终浓度为1-10％的NP-40、1-100mg/mL的chelex-100、1-20mM的pH8.0的Tris-Ac以及超纯水。

7.如权利要求5所述的肺炎衣原体快速检测试剂盒，其特征在于，所述复溶液含有终浓度为10-50mM的MgAc2、80-100mM的pH8.0的Tris-Ac、55-70mM的KAc、5-15％的PEG20000及超纯水。

8.如权利要求5所述的肺炎衣原体快速检测试剂盒，其特征在于，所述含引物探针的EMA反应管的成分如下：每个反应管中含有终浓度为6-60ng/μl的单链DNA结合蛋白、16-160pg/μl的ATP再生蛋白、1-10ng/μl的DNA解旋酶、1-5ng/μl的DNA聚合酶、5-150pg/μl的DNA限制性内切酶、200-500pg/μl的辅助蛋白、200-500nM的上游引物、200-500nM的下游引物、1-50nM的探针、1-50mM的磷酸肌酸钠、1-10mM的ATP、50-150μM的dNTP、50-100mM的Tris-Ac、5-50μg/μl的海藻糖、100-500mM的KAc、1-10ng/μl的甘露醇、1-10％的PEG20000。

9.如权利要求5所述的肺炎衣原体快速检测试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为超纯水空白对照，所述阳性质控品是含有目的序列的质粒，浓度是1*10⁴copies/μl。

10.一种肺炎衣原体的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用权利要求5所述的肺炎衣原体快速检测试剂盒，所述检测方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述检测方法包括以下步骤：

(1)使用权利要求5所述的检测试剂盒，将目标样本拭子放到500μl裂解液中并剪断，涡旋振荡30秒，5000转/分，离心1分钟，取100μl上清液转移到新的1.5mL离心管中，金属浴90℃加热裂解10分钟，随后冷却到室温，取上清进行检测；

(2)使用权利要求5所述的检测试剂盒，取10μl复溶液及10μl样本裂解所得上清，加入到含引物探针的EMA反应管中，充分混匀，另设置阳性及阴性对照；

(3)将复溶的EMA反应管放入Click i核酸荧光检测仪中，37-45℃扩增10-30分钟，每30秒扫描荧光一次，采集荧光数据，绘制时间-荧光信号图；

(4)结果质控：阳性质控品Ct值＜20，荧光曲线为典型“S”型，阴性质控品无Ct值，以上条件均满足，本次实验有效，否则无效，需要排查原因并重新测试；

(5)结果判断：如果样本扫描荧光曲线为典型“S”型，且Ct值＜30，则判断为阳性结果；反之，扫描荧光曲线为水平直线，无Ct值，则为阴性结果。